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ISSN : 1225-0171(Print)
ISSN : 2287-545X(Online)
Korean Journal of Applied Entomology Vol.64 No.1 pp.21-30
DOI : https://doi.org/10.5656/KSAE.2025.01.1.067

Microbial Interactions in the Green Peach Aphid Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae) Insights from Microbiome Analysis

Byung-Hyuk Kim*, Jong-Ok Jang1, Jung-Eun Kim, Chun Hwan Kim, Hyun-Hee Han, Jeong Joon Ahn**
National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA, Jeju 63240, Korea
1Division of Horticulture & Medicinal Plant, Andong National University, Andong 36279 Korea
*Corresponding author:tiger417@korea.kr
**Corresponding author:j2ahn33@korea.kr
November 27, 2024 January 17, 2025 February 10, 2025

Abstract


The green peach aphid (Myzus persicae Sulzer, Hemiptera: Aphididae) is a significant agricultural pest, inflicting economic loss on vegetable crops, fruit trees, and ornamental plants. To elucidate the interactions between M. persicae and its endosymbiotic microbial communities, the microbiota of aphids maintained in isolated rearing conditions for approximately two years were analyzed using 16S rRNA gene sequencing. The dominant microbial taxa identified included γ-proteobacteria, such as Buchnera sp., Pseudomonas sp., and Propionibacterium sp. Quantitative PCR revealed that the bacterial community size was approximately 4,300 times greater than the fungal community size. Among these, Buchnera sp., a γ-proteobacterium, exhibited a highly intimate symbiotic relationship with the host aphid. These findings contribute foundational knowledge toward understanding the interactinos between M. persicae and its associated microbial communities, with implications for the management of this pest species.


Myzus persicae , Buchnera sp. , diversity , microbial community

복숭아혹진딧물의 미생물 상호작용: 미생물 군집분석을 통한 통찰

김병혁*, 장종옥1, 김정은, 김천환, 한현희, 안정준**
제주시 농촌진흥청, 국립원예특작과학원, 온난화대응농업연구소
1국립안동대학교 원예 및 약용식물학과

초록


복숭아혹진딧물(Myzus persicae Sulzer, Hemiptera: Aphididae)은 채소작물, 과수작물과 화훼작물에 발생하여 농업과 원예작물에 경제적 피해를 주는 주요 해충이다. 복숭아혹진딧물과 기주내부 미생물간의 상호작용을 이해하기 위해, 격리된 사육시설에서 약 2년간 누대사육된 복숭아 혹진딧물 내의 미생물 군집구조는 16S rRNA gene을 이용하여 분석하였다. 복숭아혹진딧물에 우점하는 미생물은 γ-proteobacteria에 속하는 Buchnera sp., Pseudomonas sp., Propionibacterium sp. 등이 주요 우점하는 것을 확인되었다. 미생물 군집크기분석은 정량 PCR을 통해 분석하였으며, 박테리아 군집의 크기가 곰팡이 군집보다 약 4,300배 큰 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 복숭아혹진딧물 내부에는 γ-proteobacteria 에 속하는 Buchnera sp.가 기주와 매우 밀접한 상호관계가가 이루어진다고 판단되어진다. 본 연구의 결과는 복숭아혹진딧물과 기주내부 미생물간의 상호작용을 이해하는데 기초자료로 제공될 수 있을 것으로 기대된다.


복숭아혹진딧물 , Buchnera sp. , 다양성 , 미생물군집

    복숭아혹진딧물(Myzus persicae Sulzer)은 전 세계적으로 분포하며, 채소작물, 과수작물, 화훼작물 등에 발생하여 농업 및 원예작물에 심각한 경제적 피해를 유발하는 주요 해충이다. 복 숭아혹진딧물은 배추, 무, 양배추, 상추, 고추, 수박 등 다양한 채소작물뿐만 아니라 복사나무와 같은 과수 및 심비디움과 국화 등 화훼작물에 피해를 준다. 이들은 식물 체액을 흡즙하여 작물 생육을 저해할 뿐 아니라, 약 100종 이상의 식물바이러스를 매개하는 것으로 보고되었다(Dixon, 1998;Jeon et al., 2008;Minks and Harrewijin, 1988;Vuong et al., 2003). 특히, 복숭아혹진딧물은 배추과(Brassicaceae), 콩과(Fabaceae), 가지과(Solanaceae) 작물 등 400 여종 이상의 식물에 피해를 주며, 적합한 환경 조건에서는 단위생식을 통해 개체군을 빠르게 증가시킨다(Blackman and Eastop, 2007;Hong et al., 2019;Tang et al., 2019).

    곤충은 지구상에서 가장 다양하고 풍부한 동물군 중 하나로, 곤충의 장내에는 다양한 미생물이 공존하고 있다(Dillon and Dillon, 2004;Engel and Moran, 2013). 곤충 장내 공생미생물은 기주의 대사조절, 소화효율 향상, 병원균 억제, 독성물질 분해, 비타민과 같은 미량영양소 제공 등 곤충 생리에 중요한 기능을 수행한다고 알려져 있다(Dillon and Charnley, 2002;Engel and Moran, 2013;Kaufman and Klug, 1991;Schmidt and Engel, 2021). 또한, 장내 미생물 군집의 불균형은 사람의 경우 비만, 제 2형 당뇨병, 비알코올성 지방간 질환, 심혈관 질환, 영양실조 등 다양한 대사 관련 질환 발병에 관여하는 것으로 밝혀져 그 중요성이 강조되고 있다(Clemente et al., 2012;Fan and Pedersen, 2020;Gomaa, 2020).

    곤충과 장내 미생물간 상호작용은 상리공생(mutualism), 편리공생(commensalism), 편해공생(parasitism) 등 다양한 형태로 나타나며 이러한 관계를 이해하기 위해서는 미생물 군집 구조 및 기능 분석이 필수적이다(Baumann, 2005;Margulis and Fester, 1991;Moran, 2006;Walker et al., 1999). 동일한 환경 내 미생물은 다른 미생물과의 상호작용을 통해 군집을 형성하며, 개별 미생물과는 상이한 생리적 특성을 나타낸다. 따라서, 미생물을 개별적으로 이해하기보다는 군집 단위로 연구하는 것이 생태학적 및 생리학적 이해를 확장하는데 중요하다. 하지만 전통적 배양 방법은 전체 미생물 중 1%미만만을 배양할 수 있어 미생물 다양성 및 군집 구조 분석에 한계가 있다. 이를 극복하기 위해 16S rRNA 유전자 염기서열분석과 같은 분자생태학적 기법이 미생물 군집분석에 널리 활용되고 있다(Kim et al., 2017;Kim et al., 2022).

    본 연구에서는 약 2년간 누대사육된 복숭아혹진딧물의 미생물 군집 구성과 다양성을 16S rRNA 기반 분자생태학적 기법을 통해 분석하였다. 이 결과는 복숭아혹진딧물과 미생물간 상호관계를 이해하는데 필요한 기초자료를 제공할 것으로 기대된다.

    재료 및 방법

    복숭아혹진딧물 사육

    날개가 없는(무시형) 복숭아혹진딧물은 2021년 국립농업과 학원으로부터 분양받아 사육용 상자(30 × 30 × 35 cm)에서 담배를 기주식물로 이용하여 누대사육 하였다. 사육조건은 온도 21±1°C, 상대습도 60±10%, 광주기 16:8(명:암)을 유지하였다. 실험에 사용된 담배종자는 국립농업과학원 작물보호과에서 분양받았으며 상업용 토양(부농)을 사용하여 직경 13 cm, 높이 10 cm의 플라스틱 화분에 재배하였다. 무시형 복숭아혹진딧물 개체군을 지속적으로 유지하기 위해 진딧물이 밀집되지 않도록 일주일에 한번씩 새로운 담배 잎을 공급하였다.

    DNA 추출

    복숭아혹진딧물 내 미생물 군집분석은 분자생태학적 기법을 활용하였다. 복숭아혹진딧물의 DNA는 5마리를 사용하여 추출 하였다. DNA 추출 전, 표면 미생물 제거를 위해 복숭아혹진딧 물에 75% ethanol 5 분, 2% NaOCl 5 분, 10% NaHCO3 10분 순으로 처리한 뒤 멸균수로 3회 세척하였다(Nxumalo et al., 2020). 전 처리된 진딧물은 Fast DNA Spin kit for Soil (MP bio, CA, USA)을 이용하여 DNA를 분리·정제하였다. 추출된 DNA의 농도와 순도는 NanoDrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 사용하여 측정하였으며, 각 시료의 DNA 농도는 50 ng/μl 이상, 순도는 1.8~2.0으로 연구에 적합한 수준이었다.

    16S rRNA 유전자 클론 라이브러리(gene clone library) 제작

    미생물 군집분석을 위해 16S rRNA 유전자 클론 라이브러리 분석을 수행하였다. PCR 증폭에는 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1541R (5'-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3') primer를 사용하였다(Forney et al., 2004). PCR 반응 혼합물은 1× PCR buffer, 20 mM MgCl2, 40 mM dNTP mixture, 각 primer (1 μM), template DNA (1 ng/μl)와 0.5 U Taq polymerase로 구성된 50 μl로 준비하였다. PCR 반응 조건은 94°C에서 5분 동안 DNA를 pre-denaturation 후, 94°C에서 1분 denaturation, 60°C에서 1분 annealing, 72°C에 서 1분 30초 extension하고, 25 cycles 수행한 한 후, 72°C에서 5분 동안 final extension을 진행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.2 % agarose gel에서 loading하였으며, 약 1,500 bp band를 절단하고, HiGeneTM Gel & PCR Purification Solution Kit (Biofact, Daejeon, Korea)를 이용해 정제하였다. 정제된 DNA는 All-inone PCR cloning kit (Biofact, Daejeon, Korea)를 사용해 ligation 후, E. coli DH5α (RBC Bioscience, Taipei, Taiwan)에 형질전환하고 LB+kanamycin 배지에서 배양하여 생성된 49 개 colony를 16S rRNA 유전자 분석에 사용하였다.

    미생물 군집 분석을 위한 PCR

    미생물 다양성 분석은 1차 PCR과 nested-PCR로 수행하였다 (Muyzer, 1999;Muyzer et al., 1993). 1차 PCR은 27F 및 1541R primer를 사용하여 수행하였으며, 반응 혼합물 및 조건은 앞서 언급된 방법과 동일하다. PCR을 조건은 94°C에서 5분 동안 DNA를 변성시킨 후, 94°C에서 45초 denaturation, 56°C에서 45초 annealing, 72°C에서 45초 extension을 25 cycles을 수행하고, 72°C에서 5분 동안 final extension을 진행하였다. PCR 산물은 ethidium bromide로 염색 후 1.2% agarose gel에서 확인하였다. Double Gradient-Denaturing gradient gel electrophoresis (DG-DGGE) 분석을 위해, 1차 PCR의 증폭산물을 주형으로 2차 PCR을 수행하였다. 이때 16S rDNA를 증폭하기 위하여 사용된 primer는 40개의 GC-clamp가 붙은 341F-GC (5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')와 786R (5'-CTA CCA GGG TAT CTA ATC-3')을 이용하였다(Forney et al., 2004;Ishii and Fukui, 2001;Jaspers et al., 2001). 2차 PCR을 위한 PCR 조성물은 1차 PCR에 사용된 것과 동일하며 1차 PCR 증폭산물 1 μl를 template로 사용하였다. 2차 PCR 반응조건은 94°C에서 5분 동안 DNA를 변성시켜, 94°C에서 45초 denaturation, 60°C에서 45초 annealing, 72°C에서 45초 extension하고 72°C에서 7분 동안 final extension을 수행하였다. Annealing 온도는 초기에 60°C에서 시작해 1 cycle 당 0.5°C 감 소하게 20 cycles 수행하였고, 그 후 50°C에서 15 cycles을 수행하여 touch-down PCR을 완료하였다. 증폭된 2차 PCR 산물은 DG-DGGE분석에 사용되었다(Muyzer et al., 1993).

    DG-DGGE 분석

    PCR 산물은 DcodeTM System (Bio-Rad, CA, USA)을 이용 해 DG-DGGE를 수행하였다(Muyzer et al., 1993). Double gradient- denaturing gradient gel은 8~12% polyacrylamide (37.5:1 =acrylamide:bisacrylamide)에 40%~70% urea와 formamide 농도 구배를 형성하여 제작하였다. 제작된 DG-DGGE gel에 PCR 증폭산물을 40 μl씩 loading하고 1× TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, pH 8.0)에서 85°C, 110V로 21시간 동안 전기영동하였다. 전기영동 후 DG-DGGE gel은 ethidium bromide (1:10,000)로 염색하고 UV로 확인하였다 (Kim et al., 2017;Kim et al., 2014).

    염기서열분석

    DG-DGGE 상에 다른 위치에 존재하는 DNA band들을 회수하여, 3차 DW 50 μl를 첨가하고 4°C에서 하룻밤 동안 방치하여 상등액을 취하였다. Band에서 회수한 DNA는 nested PCR에 사용한 primer를 이용하여 재증폭을 수행하였다. PCR 증폭산 물은 agarose gel에서 전기영동하여 HiGeneTM Gel & PCR Purification Solution Kit (Biofact, Daejeon, Korea)로 정제한 후 cloning을 수행하였다. Cloning은 All-in-one PCR cloning kit (Biofact, Daejeon, Korea)을 이용하였고, manufacturer’s protocol을 따라 수행하였다. 정제된 plasmid DNA의 염기서열은 automatic DNA sequencer (model 377; Applied Biosystems, Foster, USA)를 이용하였으며, M13-20F와 M13-20R (All-in-one Vector Systems manual)을 이용하여 분석하여 16S rRNA gene 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 각 밴드별로 3반복 수행하여 ClustalX를 이용하여 alignment하여 염기서열을 확인 하였으며, NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank database를 이용하여 BLAST search를 통해 분석하였다(Thompson et al., 1997). Phylogenetic tree는 ClustalX를 이용하여 분석된 미생물간의 상동성을 분석하고, MEGA 5.0의 neighbor-joining method를 이용하여 유전적 계통분류를 수행하였다(Kim et al., 2022;Lee et al., 2012;Tamura et al., 2011).

    미생물 군집 크기 정량을 위한 Real time PCR

    복숭아혹진딧물 내 미생물 군집(박테리아, 곰팡이, 고세균) 간 크기는 qPCR을 수행하여 정량분석하였다. 박테리아, 곰팡이, 고세균의 정량 분석은 표준 유전자(artificial standard clone)를 제작하여 시료내 미생물 군집의 크기를 계산하였다. 박테리아 표준 유전자 제작은 27F와 518R (5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3') primer를 이용하였고(Muyzer et al., 1993), E. coil DH5α의 total DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 박테리아 16S rRNA 유전자인 491 bp의 PCR 산물을 얻었다. 곰팡이 표준 유전자 제작은 SR-4F (5'-AG CCG CGG TAA TTC CAG CT-3')와 SR-7R (5'-TCC TTG GGC AAA TGC TTT CGC-3') 을 이용하였고, Aspergillus total DNA를 주형으로 하여 곰팡이 18S rRNA 유전자인 388 bp의 PCR산물을 얻었다(Nakayama et al., 1996). 고세균 표준 유전자는 arch-21F (5'-TCC GGT TGA TCC YGC CGG-3')와 arch-516R (5'-GGT DTT ACC GCG GCK GCT G-3')을 이용하였고, 미생물발효차인 청태전의 total DNA를 이용하여 496 bp의 고세균 16S rRNA 유전자를 확보하였다(Gantner et al., 2011). 각각의 PCR 산물은 Allin- one vector (Biofact)에 cloning하였으며, plasmid DNA는 HiGeneTM Plasmid Mini Prep Kit (Biofact)를 이용하여 추출하였다. 염기서열분석은 M13-20F와 M13-20R (All-in-one Vector Systems manual)을 이용하여 분석하였고, BLAST search를 통해 확인하였다(자료 미제시). 염기서열이 확인된 plasmid DNA는 real-time PCR 기기를 이용하여 melting curve (Bio-Rad) 분석 후 정량분석을 위한 표준 유전자(artificial standard clone)로 사용하였다.

    정량 PCR을 위해 CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)과 iTaq™ SYBR® Green Supermix with ROX (Bio-Rad)을 이용하였다. 박테리아 16S rRNA 유전자 정량 PCR은 각각의 primer를 이용하였으며 반응조건은 95°C에서 15분 동안 pre-denaturation 시켜, 95°C에서 30초 denaturation, 67°C 에서 30초 annealing, 72°C에서 30초 extension후 fluorescence 를 측정하고 45 cycles을 수행하였다. 그리고 final extension은 72°C에서 5분 동안 수행하였다. Melting curve 분석은 65°C부터 95°C까지 0.2°C씩 증가시키면서 fluorescence를 측정하였다. 곰팡이 군집과 고세균 군집의 정량을 위해서 앞서 사용된 PCR program을 이용하였으며, annealing 온도는 69°C와 68°C 에서 각각 수행하였다.

    정량 분석은 박테리아, 곰팡이, 고세균 표준 유전자를 serial dilutions하여 Real time-PCR을 수행하였으며, DNA 농도는 NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific)을 이용하여 1 ng/μl 을 분석에 이용하였다(Kim et al., 2022).

    결과 및 고찰

    복숭아혹진딧물은 전 세계적으로 널리 분포하며, 주요 해충으로 알려져 있다. 이 해충은 환경 변화에 대한 높은 적응력과 짧은 개체 순환 주기를 가지고 있으며, 약제에 대한 내성을 빠르게 형성하는 특징이 있다(Silva et al., 2012). 본 연구에서는 복숭아혹진딧물과 장내 미생물 간의 상호작용을 분석하여, 곤충의 생리적 적응 및 생태적 성공에 미치는 영향을 조사하였다.

    DG-DGGE를 통한 미생물 군집 분석

    본 연구에서는 복숭아혹진딧물내 미생물 군집 구조를 분석하기 위해 DG-DGGE 기법을 활용하였다. 연구에 사용된 복숭아혹진딧물은 2021년 국립농업과학원에서 분양받아 온난화대 응농업연구소에서 2년간 누대사육하여 환경 요인의 영향을 최소화하고 장내 미생물 군집의 안정화를 유도한 개체들로, 기주-미생물 간의 상호작용을 정확히 이해하기 위한 기반을 마련하였다. 기존 단일 농도구배(urea-formamide)를 이용한 DGGE 기법은 동종 중합체를 분리하는 데 한계가 있었으나, 이를 개선한 이중 농도구배(urea-formamide와 acrylamide/bis-acrylamides)를 이용한 DG-DGGE 기법은 미세한 염기서열 차이를 효과적으로 구분하며, 단일 DGGE보다 다양한 크기를 분리할 수 있는 장점을 가지고 있다(Cremonesi et al., 1997;Petri and Imhoff, 2001;Scarpellini et al., 1999). 본 연구에서는 시료로부터 total DNA를 분리·정제한 후, bacterial universal primer 341F-GC와 786R을 사용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하였다. 증폭된 DNA는 DG-DGGE를 통해 분석되었으며, 미생물 군집의 주요 패턴을 확인하였다(Fig. 1). DG-DGGE 분석 결과, 복숭아혹진딧물의 장내에서 총 16개의 주요 밴드가 관찰되었으며, 각 밴드는 NCBI GenBank database에서 BLAST 분석을 통해 동정되었다(Table 1). 동정 결과, 다음과 같은 우점 미생물이 확인되었다: Acidovorax sp. (밴드 2, 8), Caulobacter sp. (밴드 7), Paraburkholderia sp. (밴드 3, 4, 15, 16), Pseudomonas sp. (밴드 5, 6), Ralstonia sp. (밴드 11, 12, 13, 14), uncultured bacterium (밴드 1, 9, 10). 분석 결과, 복숭아혹진딧물 장내에서는 8종의 미생물이 우점하는 것으로 확인되었으며(Table 1), 이들 미생물은 복숭아혹진딧물의 생리적 기능 및 생태적 적응에 중요한 역할을 할 가능성이 높다. Pseudomonas sp.는 곤충의 환경 스트레스 저항성과 관련된 미생물로, 독성 화합물의 해독 및 중금속 스트레스 완화에 기여하는 것으로 알려져 있다(Raffaelli et al., 2022;Wang et al., 2023;Zhang et al., 2022). Paraburkholderia sp.와 Ralstonia sp.는 식물의 뿌리나 잎에서 흔히 발견되는 세균으로, 기주 식물과 곤충 간의 상호작용을 매개하는 역할을 할 수 있다 (Buchner, 1965;Margulis and Fester, 1991). 특히, DG-DGGE 기법을 통해 밝혀진 미생물 군집 구조는 복숭아혹진딧물이 다양한 환경적 요인에 적응하는 데 기여하는 주요 메커니즘을 제시한다. 이전 연구에서는 기주 곤충의 미생물 군집이 곤충의 섭식 식물과 지역적 환경 조건에 따라 크게 달라질 수 있음이 보고 되었으며, 본 연구 결과는 이러한 보고를 뒷받침한다(Mouton et al., 2007;Zhang et al., 2016).

    16S rRNA Gene Clone Library를 통한 미생물 군집 분석

    DGGE를 이용한 미생물 군집분석은 DNA 염기서열의 차이를 구분할 수 있어 유전적 다양성이나 돌연변이 분석에 효과적이며, 방사성 물질없이 DNA를 시각화할 수 있는 장점이 있다. 그러나, DGGE기법은 500 bp 이상의 긴 염기서열 분석은 urea 와 formamide 농도구배에 의한 변성에 한계를 보여, 500 bp 이상 DNA 염기서열 분석에 있어 한계를 보이고 있다(Muyzer et al., 1993;Ziembińska-Buczyńska et al., 2014) 이에, 복숭아혹진딧물의 미생물 군집 다양성과 주요 우점 군집의 크기를 분석하기 위한 16S rRNA gene clone library를 구축하여, 보다 긴 염기서열을 분석하였다. Bacterial universal primer 27F와 1542R 을 사용하여 PCR을 통해 증폭된 산물을 TA cloning한 후, 49개 의 16S rRNA gene 염기서열을 확보하였다. 확보된 염기서열은 NCBI의 GenBank database에서 BLAST 분석을 통해 동정하였다. 분석 결과, Buchnera sp. C1 (36.7%, KX390632)이 가장 높은 점유율을 보이며 우점 미생물로 확인되었고, 그 뒤를 이어 uncultured bacterium clone ncd2607b01c1 (22.4%, JF228138), uncultured bacterium clone Guaymas Big B13D10 (8.2%, KC901614)가 주요 군집으로 나타났다(Fig. 2). Buchnera aphidicola (4.1%, M63248), Buchnera aphidicola strain BJ-Tobacco (2.0 %, AY849937)를 포함한 Buchnera sp.의 다양한 유전형이 관 찰되었으며, Buchnera sp.는 전체 군집의 42.8%를 차지하여 복숭아혹진딧물의 생리적 기능에서 중요한 역할을 할 가능성을 보여주었다. 그 외에도 uncultured bacterium (6.1%, MW862536), Acidovorax sp. (4.1%, MN865279), Pseudomonas aeruginosa (4.1%, MF144540), uncultured Paraburkholderia sp. (4.1%, MK547291), uncultured Propionibacterium sp. (4.1%, KX078229) 등이 확인되었다. 분석된 미생물 군집은 다양한 계통군으로 구성되어 있으며, γ-proteobacteria에 속하는 Buchnera sp., Pseudomonas sp., Propionibacterium sp.가 주요 우점 미생물로 확인되었다(Fig. 3). 또한, α-proteobacteria에 속하는 Caulobacter sp.와 β-proteobacteria에 속하는 Acidovorax sp., Paraburkholderia sp., Ralstonia sp.가 복숭아혹진딧물의 군집에서 확인되었으며, Cyanobacteriota의 존재가 특이하게 관찰되었다.

    미생물 다양성 분석방법은 다양한 기법들이 제시되고 있으며, PCR 활용 미생물 다양성 분석방법은 16S rRNA gene 분석을 통해 시료내 미생물 군집구조를 확인할 수 있다(Kaplan et al., 2014;Stefani et al., 2015;Guo et al., 2016;Quadros et al., 2016;Kim et al., 2017). PCR기반 16S rRNA gene 분석방법은 다양한 primer를 사용하고 있다. 그러나, primer에 따라 검출할 수 있는 미생물 종의 차이가 난다고 보고되었으며(Forney et al., 2004), DG-DGGE와 16S rRNA gene clone library 분석 결과 차이는 분석에 이용된 primer에 의한 것이라 판단되어진다. 이것은 미생물 군집구조를 분석함에 있어 동일한 기법을 사용하더라도 사용하는 primer에 따라 결과치가 달라질 수 있음을 의미한다. 이와 같은 문제점 보완을 위해 미생물 다양성 분석시 2가지 이상의 분석기법을 활용하여 미생물군집구조를 비교·분석하는 것이 바람직한 것으로 알려졌다(Kim et al., 2009;Kim et al., 2014;Kim et al., 2017). 따라서, 본 연구에서 DG-DGGE 기법과 16S rRNA gene clone library 분석방법을 통해 미생물 군집구조를 분석하였으며, 그 결과 복숭아혹진딧물내 우점 미생물 군집은 Buchnera sp.가 우점하는 것을 확인하였다.

    생태계에 존재하는 동물과 식물은 다양한 미생물들과 기생, 공생과 같은 상호작용을 통해 생존과 번영을 이어가고 있다 (Buchner, 1965;Margulis and Fester, 1991;Ruby et al., 2004). 곤충 내부에 서식하는 공생 미생물은 곤충의 생존에 필수적이며, 특히 소화기관에 서식하는 미생물은 곤충의 영양 흡수와 소화, 심지어 유전적 특성에도 영향을 미치는 것으로 보고되었다 (Engel and Moran, 2013;Genta et al., 2006;Ishikawa, 1989;Schmidt and Engel, 2021). 본 연구에서 우점종으로 확인된 Buchnera sp.는 거의 모든 진딧물(Aphididae)에서 발견되는 공생미생물로, 기주 곤충에게 필수 아미노산과 비타민을 공급하며 기주와의 공생관계를 통해 후대에 전파된다(Baumann, 2005;Douglas, 1998;Febvay et al., 1995;Miura et al., 2003;Munson et al., 1991;Nakabachi and Ishikawa, 1999). 본 연구에서도 복숭아혹진딧물 내 Buchnera sp.가 군집의 42.8%를 차지하며 우점 미생물로 확인되었고, 이는 이 미생물이 기주 곤충 생존과 번식에 있어 중심적인 역할을 한다는 점을 재확인해준다.

    공생미생물의 밀도는 곤충이 섭취하는 식물의 종류와 식물의 2차 대사산물, 환경 요인에 따라 달라진다(Mouton et al., 2007;Zhang et al., 2016). Buchnera sp.의 밀도는 기주 진딧물의 건강 상태와 섭취한 식물의 종류에 따라 변동하며, 이는 환경적 변화가 공생 관계의 균형에 미치는 영향을 보여준다. 이러한 밀접한 상호작용은 진딧물과 Buchnera sp. 사이의 공진화(co-evolution) 관계를 잘 나타낸다(Yao, 2019).

    Pseudomonas sp.는 본 연구에서 확인된 또 다른 주요 미생물로, 곤충 장내에서 흔히 발견되며 곤충의 환경 적응에 중요한 역할을 한다. 특히, Pseudomonas aeruginosa Y12는 곤충이 중금속에 노출되었을 때 독성 화합물의 독성을 완화하고 중금속 해독을 돕는 것으로 알려져 있다(Raffaelli et al., 2022;Wang et al., 2023;Zhang et al., 2022). 진딧물에게 가지과식물을 섭식시키면, 장내 미생물 군집 내 Pseudomonas sp.의 크기가 약 69.4%로 증가하며, 주요 공생미생물인 Buchnera sp.의 밀도가 감소하는 결과를 보였다(He et al., 2021). 이는 장내 미생물 군집이 섭식 식물에 따라 크게 변동하며, 외부 환경 요인에 민감하게 반응 한다는 점을 시사한다. Propionibacterium sp.는 복숭아혹진딧물 장내 미생물 군집에서 4.1%를 차지하며, 식물의 allelochemical (glucosinolate) 분해를 통해 곤충이 식물의 화학적 방어 물질에 적응할 수 있도록 돕는 것으로 알려져 있다(Leite-Mondin et al., 2021;Zhao et al., 2022). 이는 복숭아혹진딧물이 새로운 식물 자원을 이용하거나 환경 적응력을 높이는 데 중요한 역할을 할 가능성을 제시한다.

    본 연구에서 특이하게 관찰된 Cyanobacteria의 존재는 곤충 장내 미생물 군집 연구에서 새로운 발견으로 주목된다. Cyanobacteria는 딱정벌레과 Harpalus pensylvanicus 및 Rhynchophorus ferrugineus의 장내에서도 발견된 바 있으나, 그 기능은 아직 명확히 규명되지 않았다(Liao et al., 2020;Lundgren and Lehman, 2010). Cyanobacteria는 곤충의 대사 조절, 산화 스트레스 저항성 또는 기타 생리적 과정에 관여할 가능성이 있으며, 이와 관련된 추가 연구가 필요하다.

    Real-Time PCR을 이용한 미생물 군집 크기 분석

    복숭아혹진딧물의 내부 미생물 군집에서 우점 미생물의 다양성과 크기를 분석하기 위해 Real-Time PCR을 이용하여 eubacteria, fungi, archaea의 총균수를 정량적으로 평가하였다 (Table 2). 분석 결과, 박테리아의 총균수는 6.91 × 104 ± 8.78 × 103 molecule·copy μl-1로 확인되었으며, 이는 곰팡이의 총균수 1.60 × 10 ± 8.67 × 100 molecule·copy μl-1에 비해 약 4,300배 높은 수준이었다. 고세균은 검출되지 않았다. 이 결과는 복숭아혹진딧물 내부에서 박테리아 군집이 주요 미생물 군집으로 존재하며, 진딧물의 생리적 과정과 생태적 적응에서 핵심적인 역할 을 수행할 가능성을 시사한다.

    본 연구는 Real-Time PCR을 이용하여 복숭아혹진딧물 장내 미생물 군집의 크기를 정량적으로 평가하였으며, 박테리아 군집이 곰팡이보다 매우 큰 것으로 확인되었다. 이는 복숭아혹진 딧물 내부에서 박테리아 군집이 생리적, 대사적 과정에 있어 주요 역할을 하고 있음을 나타낸다. 박테리아는 곤충 장내에서 다양한 기능을 수행하며, 기주의 영양 흡수와 소화에 기여하는 것으로 알려져 있다(Dillon and Dillon, 2004;Engel and Moran, 2013). 특히, 가장 우점하는 박테리아로 확인된 Buchnera sp.는 기주 곤충에게 필수 아미노산과 비타민을 공급하며, 기주 생존과 번식에 필수적인 역할을 한다고 보고되었다(Douglas, 1998;Febvay et al., 1995;Munson et al., 1991). 박테리아의 높은 총균 수는 복숭아혹진딧물이 불리한 환경에서도 생존력을 유지할 수 있도록 도와주는 주요 요인으로 작용할 가능성이 크다(Baumann, 2005). 곰팡이 군집은 박테리아에 비해 상대적으로 낮은 총균수를 보였으나, 특정 환경에서 곤충의 소화 효소 생산이나 방어 기작에 관여할 가능성이 있다(Dillon and Dillon, 2004). 반면, 고세균이 검출되지 않은 것은 복숭아혹진딧물 내부의 환경 조건이 고세균의 생존에 적합하지 않을 가능성을 시사한다. Real-Time PCR 분석 결과는 복숭아혹진딧물 장내 미생물 군집 구조가 기주 곤충의 생리적 적응과 환경 적응에 중요한 역할을 함을 보여 준다. 특히, 공생 박테리아의 높은 밀도는 복숭아혹진딧물이 다양한 환경 변화에 적응하고 새로운 기주 식물을 이용하는 데 필수적인 요소로 작용할 가능성이 크다. 이는 곤충-미생물 간 상호 작용이 곤충 생태학에서 중요한 역할을 한다는 기존 연구를 뒷받침한다(Mouton et al., 2007;Zhang et al., 2016).

    본 연구를 통해 복숭아혹진딧물 장내 미생물 군집의 구조와 다양성이 기주 곤충의 생리적, 생태적 적응에 중요한 역할을 한다는 점을 확인하였다. 특히, Buchnera sp.와 Pseudomonas sp. 같은 주요 공생미생물은 기주 곤충의 건강 유지와 환경 적응에 핵심적인 기여를 하며, 이들의 밀도와 군집 구성은 곤충이 섭취하는 식물의 종류 및 환경 변화에 따라 조절될 수 있다. 이는 복숭아혹진딧물의 생태적 성공과 새로운 환경에서의 적응력을 이해하는 데 중요한 정보를 제공하며, 향후 미생물-곤충 간 상호작용 연구의 기초자료로 활용될 수 있을 것이다. 또한 복숭아혹진 딧물의 주요 우점 미생물 군집 크기를 정량적으로 분석함으로써, 곤충 생리학 및 생태학 연구에 중요한 기초 자료를 제공하였다. 향후 연구는 미생물 군집의 기능적 역할과 기주 곤충의 생태적 적응 전략 간의 연관성을 밝히는 데 초점을 맞출 필요가 있다.

    사사

    본 연구는 농촌진흥청 시험연구과제인 ‘기온 및 이산화탄소 변화에 따른 복숭아혹진딧물과 기생벌 상호작용 영향평가(과제번호: PJ01606001)’로 수행되었으며, 2024년 농촌진흥청 국립원예특작과학원 전문연구원 과정 지원사업에 의해 이루어진 것입니다.

    Statements for Authorship Position & Contribution

    • Kim, B.-H.: National Institute of Horticultural and Herbal Science, Post-doctoral fellow; Designed experiment, and wrote and edited the manuscript.

    • Jang, J.-O.: Division of Horticulture & Medicinal Plant, Andong National University, Researcher, Designed experiment, and edited the manuscript.

    • Kim, J.-E.: National Institute of Horticultural and Herbal Science, Researcher; Edited the manuscript.

    • Kim, C.H.: National Institute of Horticultural and Herbal Science, Senior Researcher; Edited the manuscript.

    • Han, H.-H.: National Institute of Horticultural and Herbal Science, Senior Researcher; Edited the manuscript.

    • Ahn, J.J.: National Institute of Horticultural and Herbal Science, Senior Researcher; Designed experiment, Investigated the process of experiment and wrote and edited the manuscript.

    All authors read and approved the manuscript.

    KJAE-64-1-21_F1.gif

    DG-DGGE profiles based on 16S rRNA gene generated from the Myzus persicae. The DG-DGGE was electrophoresed on an 8~12% polyacrylamide gel with a 40~70% urea-formamide gradient. The bright bands on the DG-DGGE were excised and the amplified DNA fragments partially sequenced and compared to known sequences using BLAST.

    KJAE-64-1-21_F2.gif

    Dominant bacteria OTUs detected on 16S rRNA gene clone library in the gut of Myzus persicae.

    KJAE-64-1-21_F3.gif

    Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence using the neighbor-joining methods showing the gut of Myzus persicae. * 16S rRNA gene clone library, ** DG-DGGE

    Identity of the bands obtained from 16S rRNA gene DG-DGGE bands and those of the closest relatives in the GenBank database, indicating the detected bacteria among Myzus persicae

    Quantification using the eubacterial 16S rRNA gene and fungal 18S rRNA gene

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    Vol. 40 No. 4 (2022.12)

    Journal Abbreviation Korean J. Appl. Entomol.
    Frequency Quarterly
    Doi Prefix 10.5656/KSAE
    Year of Launching 1962
    Publisher Korean Society of Applied Entomology
    Indexed/Tracked/Covered By