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일반적으로 생체아민은 살아있는 세포 내에서 중추신경의 신경전달물질이나 혈관계 조절 등 다양한 생리활성을 수행하 는 저분자 유기질소 화합물을 말하며(Cho et al., 2008), 아미노 산의 탈탄산 작용이나 아미노기 전이작용 등에 의해 생성되는 대사산물이다(Clark and Camargo, 2007;Harro and Oreland, 2001). 이러한 생체아민은 자연적으로 동식물·미생물에 의해 생성되며, 아민 산화효소(amine oxidase)의 활동에 의해 체내 에서 적정 수치를 유지하지만 일정 수준 이상의 고함량의 생체 아민은 독성을 나타내기도 한다(Shalaby et al., 1996). 특히 putrescine이나 cadaverine 같은 생체아민은 발효나 부패 시 미 생물에 의해 생성되는 생체 아민으로 식품에 있어서 미생물의 활동에 대한 지표로서 활용되어왔다(Linares et al., 2011).
로열젤리는 봉군 내 어린 유충을 비롯한 여왕벌의 먹이로 활 용되는 유백색의 점액성 물질로 특유의 비릿한 향을 갖는 물질 이다. 로열젤리는 5~15일령 일벌의 인두선에서 분비되는 물질 로 여왕벌의 경우 유충기간부터 성장 후에도 지속적으로 섭취 하지만 일벌과 수벌의 유충은 부화 후 3일간만 섭취한다 (Lercker et al., 1981). 로열젤리는 60% 이상이 수분이며 단백 질, 탄수화물, 지방, 비타민 등 다양한 물질로 구성되어 있다 (Krell, 1996). 단백질이나 지방은 온도에 높은 변성되거나 산 화되기 쉽기 때문에 로열젤리는 생산 즉시 냉동보관을 통해 저 장하며, 운반이나 보관 시 신선도 유지를 위해 저온상태를 유지 해야 했다. 이전 연구를 통해 신선도 문제와 보관이나 운반상의 어려움을 해결하기 위해 동결건조를 이용한 로열젤리의 제조 과정을 최적화하였으며(Choi et al., 2021), 동결건조 로열젤리 는 장기간 보관하더라도 유해 미생물 등에 안전했다. 본 연구를 통해 동결건조 로열젤리의 신선도를 확인하는 하나의 척도인 putrescine을 분석하기 위한 조건을 확립하고 이에 대한 분석법 을 검증하고자 하였다.
재료 및 방법
공시 시료 및 추출
본 실험에 사용된 시료는 2020년, 2021년에 생산된 로열젤 리를 한국양봉농협으로부터 구매하여 동결건조한 후 공시시료 로 사용하였다. Putrescine을 추출하기 위해 동결건조 로열젤리 3 g을 5% TCA (trichloroacetic acid) 20 ml에 녹인 후 이를 교 반기(Daihan scientific, Wonju, Korea)를 이용하여 1시간 동안 교반하였다. 추출된 용액은 원심분리기(Hanil science, Daejeon, Korea)를 이용하여 4°C에서 13000 rpm으로 21 분간 원심분리 한 후 상등액만을 취해 –20°C에서 소분하여 실험에 사용하였 다. 정량분석 및 분석법 검증을 위한 표준품으로 putresine dihyrochloride (Sigma Aldrich, USA)을 사용하였으며, 이러한 표준품은 1 mg/ml 농도로 0.1 N 염산에 녹인 후 이를 희석하여 사용하여 검량곡선을 그렸다.
Dansyl Chloride 유도체화
Dansyl chloride 유도체화는 생체아민을 유도체화하기 위해 주로 사용하는 방법으로 75 mg dansyl chloride (Sigma-Aldrich, St. Loius, MO, USA)를 Acetone (Merck, Darmstadt, Germany) 10 ml에 녹여 유도체화 용액을 만들었다. Sodium bicarbonate (Sigma-Aldrich, St. Loius, MO, USA) 2 g을 25 ml 3차 증류수에 녹여 포화된 탄산수소나트륨 용액을 제조하였으며, L-proline (Sigma-Aldrich, St. Loius, MO, USA)을 3차 증류수에 녹여 10% L-proline 용액을 만들어 실험에 사용하였다. 냉동보관된 로열젤리 추출액과 putrescine 표준용액 100 μl를 dansyl chloride 용액 400 μl와 탄산수소나트륨 용액 200 μl와 혼합하 여 60°C에서 호일로 감싸 빛을 차단하여 10 분간 반응시켜 유 도체화를 실시하였으며, 유도체화된 용액에 L-proline 용액 100 μl를 첨가하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 해당 용액에 diethyl ether (Merck, Darmstadt, Germany) 500 μl를 첨가한 후 4°C, 13000 rpm 속도로 10분간 원심분리하였으며, 상등액 만을 취하여 질소농축기(Caliper life science Inc, MA, USA)를 이용하여 농축하였다. 농축이 끝난 시료에 1 ml acetonitrile을 첨가한 후 분석에 이용하였다.
분석기기 및 분석조건
Putrescine 분석을 위한 UPLC 기기는 PDA (Photo diode array) 검출기가 장착된 Waters (Minneapolis, MN, USA)사의 ACQUITY UPLC I-class 모델을 사용하였으며, 분석조건은 Table 1과 같았다.
분석법 검증
UPLC를 이용하여 동결건조 로열젤리 내 putrescine을 분석 하기 위한 분석법 검증을 위해 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정확성(accuracy), 정밀성(precision), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 등을 평가하여 검증하였다(MFDS, Food Code, 2015). 동결건조 로 열젤리와 putrescine 표준품을 유도체화하여 각각의 UV 스펙 트럼 흡수 패턴과 머무른 시간을 비교하여 특이성을 검증하였 으며, 직선성은 로열젤리 내 putrescine 함량을 포함하는 5개 구 간의 농도를 설정하여 상관계수인 R2 값을 산출하여 확인하였 다. 정확성은 동결건조 로열젤리 시료에 3가지 농도의 표준용 액을 첨가하였을 때, ±10 범위의 회수율로 평가하였으며, 정밀 성은 정확성 검증과 마찬가지로 3가지 농도를 설정한 후 일내 (intra-day) 및 일간(inter-day) 분석을 통해 상대표준편자(relative standard deviation, RSD)를 계산하여 평가하였다. 검출한계와 정량한계는 표준품의 검량선을 이용하여 Y절편의 표준편차와 기울기에 근거하여 산출하였다.
Putrescine 함량분석
Putrescine의 함량은 putrescine 표준품을 이용하여 검량곡 선을 작성한 후 회귀식을 산출하여 정량 분석하였다.
결 과
분석조건 최적화
동결건조 로열젤리 내 putrescine을 분석하기 위해 이전의 연구에서 진행한 바 있는 정제봉독 내에 존재하는 putrescine 분석법(Choi et al., 2021)을 이용하여 분석을 실시하였다. 그러 나 Fig. 1에서 보듯이 기존 분석법을 이용하여 분석한 결과 putrescine이 머무른 시간 5.263 분에서 검출되었으나 분리능 이 좋지 않아 피크가 다소 겹쳐보이며, 피크가 끌리는 테일링이 약간 발생하였다. 그래서 용매조성 등의 조건을 달리 하여 새롭 게 분석조건을 설정하였다(Table 1). 총 분석시간은 7 분이었으 며, 이동상으로는 acetonitrile과 증류수를 사용하였으며, C18 (2.1×100 mm, 2.0 μm) 컬럼에서 오븐 온도를 20°C로 설정하 였을 때 피크 분리도가 개선됨을 확인할 수 있었다. 새로운 분 석조건에서의 동결건조 로열젤리 내 putrescine의 머무른 시간 은 5.289 분이었으며, 짧은 시간 동안 높은 분리도를 나타내었 다(Fig. 1).
분석법 검증
동결건조 로열젤리 내 putrescine을 분석하기 위해 확립된 UPLC 분석법에 대한 타당성을 검증하기 위해 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 검출한계, 정량한계 등을 평가하였다.
특이성은 유도체화된 putrescine 표준품과 동결건조 내에 동 일한 머무른 시간을 갖는 피크의 UV 흡수 스펙트럼 패턴 일치 여부를 통해 평가하였으며, Fig. 2에서 보는 바와 같이 두 피크 의 흡수 영역이 일치함을 알 수 있었다.
직선성은 동결건조 로열젤리 내 putrescine이 포함되는 농도 에 해당되는 표준품의 농도인 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250 μg/ml의 농도를 설정하여 검량선을 그려 확인하였다. 검량선 을 통해 y=4263.7x+5605.3이라는 회귀식을 산출하였으며, 상 관계수(R2) 값이 0.9999로 높은 직선성을 나타내었다(Table 2).
정밀성은 직선성을 평가한 농도 범위 내에 있는 표준품 농도 3가지(62.5, 125, 250 μg/ml)를 설정하여 일내(intra-day) 및 일 간(inter-day) 정밀도를 측정한 결과, 2% 미만의 상대표준편차 (RSD)값을 나타내어 우수한 정밀성을 갖는 것으로 확인되었 다(Table 3).
정확성은 분석시료에 직선성을 평가한 농도 범위 안의 3가 지 농도를 첨가한 후 회수율을 확인하여 평가하였다. 그 결과, 회수율의 범위는 99.4~104.1%였으며, 10% 미만의 우수한 정 확성을 나타내었다(Table 4).
검출한계 및 정량한계는 계산식에 의거하여 검량선을 그려 산출한 회귀방정식으로부터 구하였다. 계산하는데 사용된 Signal/ Noise는 baseline에 대한 잡음(noise)와 피크(peak)의 상대비로 그 값이 낮을수록 분석물질이 주어진 조건에서 잘 검출된다는 것을 나타낸다(He et al., 2015). Putrescine에 대한 검출한계 값과 정량한계 값은 각각 0.7 μg/ml와 2.14 μg/ml이었다(Table 2).
Putrescine 함량 분석
확립된 UPLC 분석법을 이용하여 국내에서 생산된 2020년, 2021년 동결건조 로열젤리의 putrescine 함량을 분석하였다. 2020년 생산된 동결건조 로열젤리 내 putrecsine 함량은 118.5± 1.34 mg/kg이었으며, 상대표준편차(RSD)값은 0.69%로 확인 되었고, 2021년 생산된 동결건조 로열젤리의 putrescine 함량은 115.3±2.02 mg/kg이었으며, 상대표준편차(RSD)값은 1.30% 였다(Table 5).
고 찰
일반적으로 생체 아민은 살아있는 세포 내에서 다양한 생리활 성을 수행하며 세포의 성장과 분화를 촉진하거나, 세포사멸을 유도하는 등 체내에서 중요한 역할을 담당하고 있다(Takao et al., 2006). 특히 putrescine과 cadaverine은 세포의 사멸과 연관 되어 있으며, 동물조직이 부패될 때 단백질 가수분해에의 의해 생성되는 물질로 알려져 있다. 이때 산성 스트레스로부터 미생 물이 세포를 보호하기 위한 대사 경로 중에 lysine 탈카르복실화 효소의 촉매 작용에 의해 합성되는 것으로 알려져 있다. 특히 putrescine은 세포조직이 부패될 때 발생하는 불쾌한 악취를 유 발하는 생체아민으로 부패의 정도를 가늠하는 척도가 되는 물질 이다(Russell, 1973). 그래서 putrescine은 식품내에 존재하는 미생물 활동에 대한 지표로 사용되었으며, 식품 내 급격한 putrescine의 수치 변화는 식품 품질의 저하나 생산과정의 결함이 발생 했음을 의미한다(Linares et al., 2011). 일반적으로 putrescine을 비롯한 생체아민 분석은 주로 HPLC를 이용한 액체크로마토그 래피 분석을 통해 실시되어져 왔으며(Mantoanelli et al., 2020;Ibarra et al., 2015), 검출기에 따라 형광을 이용하여 분석하거나 (Liu et al., 2020;Ishimaru et al., 2019) dansyl chloride 용액을 이 용하여 유도체화를 통해 UV를 이용하여 분석하기도 한다(de Figueiredo et al., 2015). 기존에 HPLC를 이용한 방법을 개선하여 본 실험에서는 UPLC를 이용하여 분석시간을 단축시키고 분석효 율을 높이는 방법을 채택하였다. 분석을 위한 기본 추출방법도 단 시간에 추출을 하는 것이 아닌 교반을 통해서 시간을 두고 추출하 는 방법을 선정하였다(Mantoanelli et al., 2020).
Putrescine과 같은 생체아민의 정량적 분석에 관한 연구는 생선, 수산물, 유제품, 채소, 고기 등 신선함을 요구하는 음식에 서 주로 보고되고 있으며(Bardócz et al., 1993;Muñoz-Esparza et al., 2019), 와인과 같은 발효주에서도 응용되고 있지만(Konakovsky et al., 2011) 실제 로열젤리에 존재하는 putrescine 분석 과 관련된 내용은 찾을 수 없었다. 본 연구에서는 봉독에서의 putrescine 분석법을 이용하여 동결건조 로열젤리 내 분석하였 지만 분리도가 좋지 않아 새로운 분석조건을 확립하였으며, 새 롭게 확립된 분석법은 C18(2.1×100 mm, 2.0 μm) 컬럼을 이용 하여 7분 이내에 신속하고 정확하게 putrescine 분석이 가능하 도록 분석법을 확립하였다. 분석법의 타당성을 평가하기 위해 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성, 검출한계, 검량한계 등의 요인 을 검증하였으며 해당 분석법을 이용하여 동결건조 로열젤리 내에 존재하는 putrescine의 정량분석을 통하여 국내에서 생산 되는 로열젤리의 신선도를 평가할 수 있는 척도로서 활용할 수 있을 것이라 판단된다.
KSAE
