파밤나방(Spodoptera exigua Hubner)은 나비목, 밤나방과 에 속하는 해충으로, 지역에 따라 차이가 있으나 우리나라의 경 우 5월말부터 11월말까지 년 4-5회 이상 발생하여 피해를 주고 있다(Kim and Kim, 1997). 주로 우리나라 남부 지역에서 그 피 해가 더 심각하였으나, 내한성 기작으로 월동이 가능하게 되고 시설 재배지의 확대와 최근의 기온상승으로 발생세대수가 증 가하면서 해마다 피해범위와 정도가 증대되고 있는 실정이다 (Kim and Kim, 1997;Zheng et al., 2011). 파밤나방은 배추, 파, 대파, 고추, 콩, 무, 수박, 장미, 국화, 감자 등의 채소, 화훼 그리 고 과수 등 40과 200여종의 식물에 피해를 주는 대표적인 광식 성 해충이다(Smagghe et al., 2003). 따라서 그 방제가 매우 중 요하게 여겨지는 해충중의 하나이지만, 연중 많은 세대 발생으 로 인하여 살충제에 대한 저항성 획득이 쉬우며, 비교적 살충제 에 감수성이 높은 어린 유충 시기에 줄기 속으로 들어가 안쪽에 서 가해를 하여 약제에 노출될 기회가 적고, 3령 유충 이상이 되 면 살충제에 대한 저항성이 강해지므로 방제가 어려운 난방제 해충으로 여겨지고 있다(Park and Goh, 1992). 최근까지 이 해 충의 방제를 위해서는 주로 유기인계, 카바메이트계, 피레스로 이드계 등의 화학살충제를 사용하고 있지만, 화학살충제의 지 속적인 사용은 환경오염 문제 유발, 해충의 약제 저항성 획득 그리고 사람들의 건강에 대한 우려로 친환경적인 방제 방법에 대한 관심이 높아지고 있다(Hernández-Martínez et al., 2009). 저항성이 크게 문제되지 않는 천적이나 다양한 미생물을 이용 하여 파밤나방의 방제를 위한 연구가 꾸준히 이루어져오고 있 으나, 파밤나방 병원성 바이러스를 이용한 바이러스 살충제만 이 현재까지 가장 효과적인 해결 방안으로 제시되고 있는 실정 이다(Moar et al., 1995;Black et al., 1997;Moscardi, 1999).

바이러스 살충제 개발에 이용되는 대표적인 곤충 병원성 바 이러스는 배큘로바이러스(baculovirus) 중의 하나인 핵다각체 병바이러스(nucleopolyhedrovirus: NPV)로서, 다른 동물 바이 러스와는 다르게 다각체(polyhedra)라는 거대한 결정성 단백 질 덩어리인 봉입체(occlusion body)내에 바이러스 입자가 매 립되어 쉽게 바이러스의 존재 여부를 확인할 수 있는 특이한 바 이러스이다(Miele et al., 2011). 핵다각체병바이러스에 의한 곤충의 치사는 다각체 상태의 바이러스를 곤충이 먹이 활동과 정 중에 우연히 섭식하게 되면, 곤충의 중장에 도달한 다각체가 중장의 강알칼리 환경에 의해 분해되면서 다각체 내의 바이러 스 입자가 방출된다(Friesen, 1997;O’Reilly et al., 1994). 그 후 방출된 바이러스 입자(occlusion derived virus)는 위식막을 통 과하고 중장 상피세포의 세포막과 융합하여 세포내로 침입하 고 바이러스의 증식이 이루어지게 된다. 초기 침입 세포에서 증 식된 바이러스 입자(budded virus)는 곤충 충체 내의 거의 모든 조직의 세포로 감염을 이어가고 바이러스 증식의 결과, 곤충은 생리 활동 저하를 비롯한 이상 증상을 보이며 다각체를 형성하 고 죽게 된다. 바이러스의 증식과정을 통해 곤충의 치사가 일어 나기 때문에, 치사에 이르기까지는 비교적 많은 시간이 소요되 며 곤충에 따라 그리고 바이러스에 따라 차이가 있으나 일반적 으로 5-7일 정도 소요된다. 핵다각체병바이러스의 다각체는 자 연 환경에서 매우 안정적으로 존재하며 바이러스 입자를 보호 하는 역할을 할 뿐 아니라 결정성 형태라는 특징으로 인해 살충 제로서 개발이 가능하였다(Rohrmann, 1986). 또한, 핵다각체 병바이러스를 비롯한 대부분의 곤충 바이러스는 곤충 외의 동 식물에는 무해하기 때문에 다양한 난방제 해충들에 대한 바이 러스 살충제로 개발되고 이용되어 오고 있다(Black et al., 1997). 파밤나방에 대해 병원성을 지닌 파밤나방 핵다각체병바이러스 (S. exigua NPV: SeNPV)를 이용한 바이러스 살충제도 국외에 서는 이미 개발되어 이용되고 있으나(Moscardi, 1999), 국내에 서는 이용된 적이 없을 뿐 아니라 그 자원 확보에 대한 연구도 매우 미약한 실정이다.

NPV를 비롯한 배큘로바이러스는 약 80-180 kb 크기의 이중 가닥의 원형 DNA 유전체(genome)로 이루어져있고(Jehle et al., 2006), 대표적인 NPV인 Autographa californica multiple NPV (AcMNPV)의 전체 염기서열이 보고된 후로(Ayres et al., 1994), 염기서열 분석 기술과 유전체학의 발달로 차세대 염기서열 분 석 기술(Next Generation Sequencing : NGS)이 소개되면서 현 재까지 배큘로바이러스 유전체는 60종 이상이 GenBank에 등 록되어 있고 지속적으로 보고되고 있다. 바이러스 살충제의 개 발을 위해서는 소재인 바이러스에 대한 자원 확보가 가장 우선 적으로 이루어져야 하며, 동시에 확보된 소재의 특성 분석을 통 해 자체 자원화가 이루어져야만 살충제 개발과 제품화가 용이 하다. 유전체 해독은 바이러스의 기본적인 유전자 서열 정보나 재조합 단백질 발현, 유전자 기능 분석, 바이러스 진화에 대한 중요한 정보를 제공할 뿐 아니라 바이러스 분리주의 고유 특성 을 제공할 수 있는 기초자료가 된다. 국내에서도 NPV의 기본 특성이나 병원성에 대한 많은 연구가 이루어져 왔으나, 유전체 에 대한 연구는 담배거세미나방 핵다각체병 바이러스(Spodoptera litura NPV: SpliNPV)와 담배거세미나방 과립병 바이러스(S. litura granulovirus: SpliGV)(Wang et al., 2011), 그리고 도둑 나방 핵다각체병 바이러스(Mamestra brassicae NPV: Mabr- NPV) 만이 보고되었고(Choi et al., 2013), 그 외에 국내 배큘로 바이러스 유전체에 대한 연구는 거의 보고되지 않고 있는 실정 이다. 따라서 본 연구에서는 국내에서 분리 확보하고 파밤나방 에 대해 그 병원성이 확인된 SeNPV에 대한 전체 유전체 분석 을 통해, 국내 분리주의 특징 파악과 더불어 국외에서 기 보고 된 SeNPV와의 차별성을 확보하고자 하였다.

재료 및 방법

곤충 사육 및 바이러스

실험에 사용된 파밤나방은 충북대학교 곤충생태 및 독성학 실험실에서 분양 받아 온도 25°C, 광조건 16L:8D, 상대습도 70% 조건으로 사육하였고, 인공사료(120 g wheat germ, 16 g yeast powder, 16 g casein, 2.4 g methyl-4-hydroxybenzoate, 1.5 g sorbic acid, 7.2 g ascorbic acid, 6 g mineral mix, 4 g vitamin mix, 1.8 mL formaldehyde solution, 2 mL linseed oil, 20 g agar, 570 mL 증류수)를 공급하여 누대 사육하며 바이러스 증 식에 이용하였다. 바이러스의 증식은 충북지역에서 분리 확보 된 SeNPV 분리주인 SeNPV-K1의 다각체를 파밤나방 유충에 경구접종하고, 사충으로 부터 바이러스 다각체를 분리 정제하 여 실험에 이용하였다.

바이러스 다각체 및 DNA 분리

바이러스의 다각체는 파밤나방 사충에 10배 부피의 0.05% SDS 용액을 첨가하고 마쇄하여 4겹의 거즈로 여과하고, 500 rpm으로 1분간 원심분리하여 유충의 찌꺼기를 제거한 후 3000 rpm으로 5분간 3-4회 원심분리를 반복하여 정제한 다음 -20°C 에 보관하면서 실험에 사용하였다. 바이러스 DNA의 분리는 정제된 다각체를 알칼리용액(0.1 M Na₂CO₃, pH 10.9)에 부유 시켜 37°C에서 30분 동안 처리하고, 13000 rpm으로 5분간 원 심분리 하여 DNA가 함유된 상청액에 SDS와 proteinase K (TaKaRa, Japan)가 각각 1%, 0.5 mg/mL가 되도록 첨가하여 37°C에서 4시간 이상 처리한 후, phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) 용액을 동량 첨가하고 혼합하여 4°C, 13000 rpm으로 5분간 원심분리하여 DNA가 함유된 상청액을 수거하 였다. 수거한 상청액에 chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) 용 액을 동량 첨가하고 혼합하여 같은 방법으로 원심분리 하여 상 청액을 분리하고 냉 에탄올로 DNA 침전을 얻어 멸균 증류수에 녹여 -20°C에 보관하면서 실험에 사용하였다.

주사전자현미경 관찰

바이러스의 다각체의 주사전자현미경(scanning electron microscope: SEM) 관찰은 알루미늄 원반 시료대 위에 정제된 다각체 부유액을 분주하고 자연건조 후, SC502 (polaron, UK) 에서 금으로 coating하여 주사전자현미경 LEO-1530 (LEO company, Germany)을 이용하여 관찰하였다.

염기서열 결정 및 gap filling

바이러스 유전체 염기서열 해독은 Macrogen (Korea)사에 의뢰하여 차세대 염기서열 분석 기술 중 Roche (Swaziland)사 의 454 pyrosequencing 방법을 통해 전체 염기서열을 결정하였 다. 결정 염기 서열은 GS De Novo Assembler version 2.6 (http://www.454.com/products-solutions/analysis-tools/gsdenovo- assembler.asp)을 이용하여 contig를 제작하고, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) databases를 통해 바이러 스 유전체 배열을 결정하였다. 결정된 유전체 염기서열은 구성 된 contig 사이 또는 내부 염기서열에 gap이 존재하는 경우, gap 영역을 얻기 위해 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 실시하였으며 사용된 primer는 표 S1와 같다. PCR은 AccuPower PCR Premix (Bioneer Co., Korea)를 이용하여 94°C 5 분 1회, 94°C 30 초, 49-64°C 30 초, 72°C 1 분 30회 반복 과정 후, 72°C 7 분의 과정을 Thermal Cycler (TaKaRa, Japan)에서 수행하였다. PCR 산물은 0.7% agarose gel에서 전기영동 하여 확인 후, DokDo-PrepTM Gel Extraction Kit (Elpis-biotech, Korea)를 이용하여 정제하고, 정제된 PCR 산물은 pTA cloning vector (RBC Bioscience, Taiwan)에 클로닝 하였다. 그 후 제 한효소(restriction enzyme)를 처리하여 확인 하고 Macrogen (Korea)사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다

유전체 구조 및 생물정보학적 분석

결정된 전체 유전체 서열을 이용하여 바이러스의 ORF (open reading frame)는 FGENESV0 (http://linux1.softberry.com/ berry.phtml)와 NCBI ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/ gorf.html) 프로그램을 이용하여 예측하였다. 예측된 ORF는 50개 이상의 아미노산을 기준으로 선발하였고, 유전자 는 ORF 간의 서열이 최소한으로 중복되게 결정되었다. 결정된 각 바이러스의 전체 ORF는 Standard protein-protein BLAST algorithm (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)의 database 에 기 보고된 서열과 비교하여 근연 관계에 있는 바이러스들과 상동성을 비교 분석하였다. 전체 유전체 염기서열 비교 분석은 PipMaker (http://pipmaker.bx.psu.edu/cgi-bin/pipmaker?advanced) 와 gVISTA (http://genome.lbl.gov/cgi-bin/GenomeVista)를 이용하여 수행하였다. 반복 염기서열의 분석은 Tandem Repeats Finder (http://tandem.bu.edu/trf/trf.html)와 JDotter (http://pgrc. ipk-gatersleben.de/jdotter) 프로그램을 사용하였다. 또한 전체 유전체 지도는 Lasergene7(DNASTAR)를 사용하여 작성하였다.

계통수

바이러스의 유전적 근연 관계를 예측하기 위해 NCBI Gen- Bank에 등록된 52종의 배큘로바이러스들(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/genomes/GenomesGroup.cgi?taxid=10442)의 27개 핵심 유전자의 아미노산 서열을 이용하였다. Cygwin (http://www. cygwin.com) 프로그램을 이용하여 아미노산 서열을 align하고 MEGA version 5.05 (http://www.megasoftware.net/)를 사용 하여 Neighbor-Joining (NJ) 방법(Saitou and Nei, 1987)을 이 용하여 계통수를 작성 하였다. 통계적 신뢰성 분석을 위해 bootstrap은 2000번 반복 수행하였다(Felsenstein, 1985).

결과 및 고찰

SeNPV-K1의 기본 특성

SeNPV-K1의 다각체 형태를 주사전자현미경으로 관찰한 결과, 지름 약 0.6~1.8 um 크기의 부정형을 나타내었다(Fig. S1). 이러한 형태는 국내에서 기 보고된 SeNPV의 다각체와 유사한 것이었다(Jin et al., 1991). 바이러스 입자를 보호하는 다각체의 형태는 바이러스에 따라 다양하게 나타나며, 육면체와 이십면 체 같이 일정한 형태를 가지는 바이러스는 소수에 불과하고 대 부분의 바이러스 일정한 모양을 보이지 않는 부정형의 다각체 를 형성한다(Rohrmann, 1986). 바이러스에 따라 다각체의 모 양이 다양한 이유에 대해서는 현재까지 밝혀지지 않고 있으며, 크기 또한 지름 0.6~2 um 내외로 바이러스에 따라 다양한 크기 를 가지는 것으로 보고되고 있다. 다각체의 외부형태만으로는 SeNPV-K1만의 고유 특징을 확인할 수 없기에 전체 유전체 분 석을 실시하였다.

전체 유전체 염기서열 결정 및 gap filling

NGS를 이용한 전체 염기서열을 결정한 결과, 기 보고된 SeNPV 유전체(NCBI GenBank Accession No. AF169823.1) 크기의 약 132배에 달하는 염기서열을 확보할 수 있었으며, 확 보된 염기서열을 assemble한 결과 1개의 contig를 얻을 수 있었 다(Fig. S2A). Contig는 BLAST를 통해 다각체 단백질(polyhedrin) 유전자의 시작 코돈인 ATG의 A염기를 시작으로 순서대로 배 열하고 BLAST를 통하여 기 보고된 SeNPV의 유전체(Ijkel et al., 1999)와 비교하였다. 그 결과, 기 보고된 전체 유전체 서열 대비 5곳에서 염기서열의 누락이 예상되었다. 누락 염기서열을 결정하기 위해 누락이 예상되는 지역 바깥쪽에서 PCR primer 를 제작하여 PCR을 수행하고 sequencing하여 gap filling을 실 시한 결과, 예상된 5곳 중 2곳에서만 실제 염기서열 누락이 있 는 것으로 확인되었다(Fig. S2B). 누락된 염기서열을 추가하여 전체 유전체 염기서열을 완성하고 GenBank에 등록하였다 (Accession no. OM746694).

전체 유전체 염기서열 분석

유전체의 전체 염기서열을 분석한 결과, SeNPV-K1은 135,756 bp 크기의 유전체를 가지며, Ijkel et al. (1999)에 의해 처음으로 보고된 SeMNPV의 유전체와 비교하면, SeNPV-K1 이 145 bp 큰 135,756 bp로 두 바이러스의 유전체 크기는 근소 한 차이를 가지는 것으로 확인되었다. G+C 함량은 SeNPV-K1 과 SeMNPV 모두 44%로 동일하게 나타났으며, 이는 NPV의 경우 A+T 함량이 높다는 기 보고와 일치하는 결과였다. 그러나 A+T 나 G+C의 함량이 생물학적으로 어떠한 의미를 갖는지는 아직 밝혀지지 않고 있다.

유전체의 ORF 분석

ORF 분석은 다각체단백질 유전자를 시작 기준으로, 50개 이상의 아미노산으로 이루어진 ORF를 선발하고 ORF 간의 중 복을 최소화하여 실시하였다. ORF 분석 결과, SeNPV-K1는 137개의 ORF를 갖는 것으로 확인되었으며, 그 중 75개가 시계 방향의 방향성을 가졌고, 62개가 반 시계방향의 방향성을 가진 것으로 확인되었다(Fig. 1, Table 1). 기 보고된 SeMNPV의 경 우에는 139개의 ORF로 2개 더 많은 것으로 확인되었다. 한편, 대부분의 NPV에 존재하며 바이러스의 복제나 감염에 영향을 주는 것으로 보고된(Zhou et al., 2012) 배큘로바이러스 반복 ORF (baculovirus repeated ORF; bro)는 기 보고된 SeMNPV 에서와 마찬가지로 SeNPV-K1에도 존재하지 않았다.

두 바이러스 간의 ORF를 비교한 결과, 132개 ORF가 SeNPV-K1과 SeMNPV에 공통적으로 존재하였으며, 두 바이 러스 간 특이적 ORF는 SeNPV-K1에 4개, SeMNPV에 6개가 각각 존재하였다(Table 1). 그 중 SeNPV-K1의 유전체에만 존 재한 것으로 확인된 ORF8 (cg30) 유전자는 다각체 형성과 전 사에 영향을 주는 유전자로 기 보고된 데이터베이스 상에서 누락 된 것으로 확인되어 SeNPV-K1은 ORF18, ORF21, ORF22가 특이적으로 확인되며, SeMNPV는 ORF17, ORF18, ORF21, ORF22, ORF23, ORF24를 특이적으로 가지고 있는 것으로 확 인되었다. 그 중 SeNPV-K1의 ORF18만이 lef7 유전자로 확인 되었으며, 나머지 ORF들은 그 기능이 보고되지 않은 것들이었 다. 두 바이러스간의 ORF의 약 1/3 이상인 50개의 ORF가 아미 노산 수준에서 100% 상동성을 갖는 것으로 나타났고, 전체적 인 평균 ORF의 상동성은 99%로 두 바이러스는 매우 유사한 유 전자를 가진 것으로 확인되었다. ORF들 중 Garavaglia et al. (2012)에 의해 37개로 알려진 배큘로바이러스의 증식에 필요 한 37개의 핵심 유전자는 SeNPV-K1과 SeMNPV에 모두 존재 하였다. 핵심 유전자의 상동성은 38k 유전자만이 93%의 비교 적 낮은 아미노산 상동성을 보였고, 나머지 36개 유전자는 97% 이상의 높은 아미노산 상동성을 갖는 것으로 확인되었다. 가장 낮은 93%의 아미노산 상동성을 보인 ORF65 (38k) 유전자는 필수 유전자로 바이러스 복제에 필수적인 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid) 형성에 있어서 vp1054, vp39, vp80 유전자와 상 호작용하는 것으로 밝혀져 있다(Wu et al., 2006;Wu et al., 2008). 38k 유전자와 상호작용하는 유전자 vp80(ORF59), vp39(ORF73), vp1054(ORF103)은 SeNPV-K1과 SeMNPV에서 96-100%의 높은 아미노산 상동성을 가지며, 38k 유전자가 비교적 낮은 상동 성을 가지긴 하나 여러 유전자와 상호작용하기 때문에 두 바이러 스 간에 유전자의 기능 차이는 크지 않을 것으로 예상되었다.

상동반복영역

배큘로바이러스의 유전자 외에 유전체내에 존재하는 중요 서열로 상동반복영역(homologous repeated sequence: hrs)이 알려져 있다. Hrs는 거의 모든 배큘로바이러스에 존재하며, 그 수는 4-13개로, 바이러스마다 차이가 크고, 크기 또한 약 30-2,000 bp로 다양하게 존재하며, 유전자가 아닌 유전자와 유 전자 사이의 반복서열로 회문 구조(palindrome sequence)로 이 루어져 있다(Theilmann and Stewart, 1992). Hrs의 기능은 아 직 정확하게 밝혀지지 않았으나, RNA polymerase II를 조절하 여 바이러스의 early 유전자의 전사를 증가시켜 바이러스의 병 원성에도 영향은 준다는 가능성이 제시되고 있다(Landais et al., 2006). SeNPV-K1에는 hrs가 6개 존재하였으며, 크기는 80-1347 bp 로 확인되었으며, SeMNPV와 큰 차이는 없는 것으 로 나타났다(Table 1).

계통수 분석

SeNPV-K1과 다른 배큘로바이러스들의 근연 관계를 알아 보기 위해 기존에 보고된 바이러스를 포함하여 56개의 배큘로 바이러스의 27개 핵심 유전자 아미노산 서열을 이용하여 Neighbour-joining (NJ) 방법으로 계통수를 작성하였다(Fig. 2). 그 결과, SeNPV-K1은 기 보고된 SeMNPV와 매우 가깝게 나 타났으며 유전적 차이 또한 크지 않을 것임을 보여주었다.

유전체의 vista 분석

ORF 분석에서 높은 상동성을 보인 SeNPV-K1과 SeMNPV 의 전체 유전체 염기서열을 이용하여 염기서열 수준에서 차이 를 보기 위해 vista 분석을 실시하였다. 그 결과, SeNPV-K1과 SeMNPV는 ORF 수준에서뿐만 아니라 전체 유전체 염기서열 이 매우 유사하게 존재함을 다시 한번 확인 할 수 있었다(Fig. 3). Coding 서열 부분은 대부분 95% 이상의 염기서열 유사성을 확 인할 수 있었으며, coding 서열이 아닌 flanked 서열 지역에서 는 염기서열의 변이가 존재 하였다. 가장 큰 차이를 보이는 지 역은 hrs로 확인되었다. 유전자 지역이 아닌 hrs 지역은 coding 서열 영역에 비해 변이가 심한 지역으로 동일한 바이러스들의 분리주 간에도 많은 차이를 보인 것으로 추정되었다.

국내에서 SeNPV-K1을 분리하여 기 보고된 SeMNPV와 유 전체를 비교 분석한 결과, 유전체 크기가 거의 동일하게 나타났 으나, ORF의 수나 크기에는 일부 차이가 확인되었다. 전체 적 인 비교 결과를 볼 때, SeNPV-K1과 SeMNPV는 매우 유사한 유전체 서열과 구성을 보이는 동일한 바이러스이지만 지역적 인 차이 또는 진화 과정에서 발생한 서로 다른 분리주임이 확인 되었다. 이러한 결과는 국내에서 분리된 SeNPV-K1의 살충제 또는 다른 응용을 위한 중요한 기초자료를 제공할 뿐 만 아니라, 국외에서 보고된 것과는 다른 고유 자원임을 확인시켜주는 것 이었다.