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ISSN : 1225-0171(Print)
ISSN : 2287-545X(Online)
Korean Journal of Applied Entomology Vol.61 No.1(Special Issue) pp.249-254
DOI : https://doi.org/10.5656/KSAE.2022.02.1.063

Improvement of Silkworm Egg Microinjection Using 3D Printing Technology

Chan Young Jeong, Chang Hoon Lee, Young-Seek Seok1, Sang Yeop Yong1, Seong-Wan Kim, Kee Young Kim, Jong Woo Park*
Department of Agricultural Biology, National Institute of Agricultural Science, Wanju 55365, Korea
1Gangwon-do Agricultural Product Registered Seed Station, Chuncheon 24410, Korea
*Corresponding author:jwpark0824@korea.kr
December 29, 2021 February 20, 2022 February 21, 2022

Abstract


Silkworms, which have for long been used as an insect resource for industrialization, have recently attracted attention as potential bio-factories for the production of novel biomaterials. In this regard, material production is typically achieved based on transformation technology, mediated via microinjection, in which a target gene is inserted into eggs containing an embryo. However, an essential step in the microinjection procedure is egg fixation, which can be a time-consuming and laborious task. Therefore, in this study, using the 3DCADian program, we adopted a 3D printing approach to model egg liners and glue drawers, which can contribute to facilitating egg alignment and fixation, thereby enhancing transformation efficiency by reducing time consumption and fatigue. After rendering using Fusion 360, the two supplementary tools were produced by printing with nylon resin (PA12) and Sinterit Lisa Pro. Subsequent analysis of the time required to fix eggs on glass slides using the two manufactured tools, revealed that the processing time was reduced by approximately 18.6% when the two tools were used compared with when these tools were not used. These innovations not only reduced fatigue but also contributed to more effective use of the microscope and manipulator for microinjection. Consequently, we believe that with additional research and refinement, the egg liner and glue drawer developed in this study could be used to enhance silkworm transformation efficiency and study similar transformation systems in other industrial insects.



3D 프린팅 기술을 이용한 누에 알 미세주입 기술 개선

정 찬영, 이 창훈, 석 영식1, 용 상엽1, 김 성완, 김 기영, 박 종우*
국립농업과학원 농업생물부
1강원도 농산물원종장

초록


오래전부터 산업곤충으로서 이용되어온 누에는 최근 바이오 신소재 생산을 위한 생체공장으로써 주목받고 있다. 소재생산을 위해서는 주 로 형질전환 기술을 이용하게 되며, 이는 배아가 있는 알 속으로 목적 유전자를 삽입하는 마이크로인젝션(microinjection) 방식으로 이루어진다. 마이크로인젝션을 위해서는 알을 고정하는 과정이 필수적이며 시간 소모 및 피로도가 높은 작업이다. 따라서 본 연구에서는 시간 소모 및 피로도 개선을 통하여 형질전환 효율을 높이고자 3D 프린팅을 이용하여 알의 정렬 및 고정에 도움을 줄 수 있는 알 배열판(egg liner) 및 접착제 줄눈판 (glue drawer)을 3DCADian 프로그램을 이용하여 모델링하고, Fusion 360를 이용하여 3차원 도면을 제작 후 프린팅하여 제작하였다. 제작된 두 도구를 이용하여 슬라이드 글라스에 알을 고정하고, 소요된 시간을 분석한 결과 도구를 사용하지 않았을 때에 비하여 2가지 도구를 이용했을 때 작업시간이 약18.6% 감소하였으며, 연구자의 작업 편의성을 향상시키고 마이크로인젝션을 위한 현미경 및 로봇 팔(manipulator) 조작을 유 리하게 하였다. 따라서 알의 배열 수 또는 조작 편의성을 개선할 수 있는 추가적인 연구 및 개량이 이루어진다면, 알 배열판 및 접착제 줄눈판이 누 에 형질전환 효율성 개선 및 다른 산업 곤충의 형질전환 연구에도 이용될 수 있을 것으로 판단된다.



    최근 식량 자원으로서 곤충의 중요성이 부각 되면서 이를 이 용하고자 다양한 곤충의 경제적, 산업적 활용을 위한 곤충 자원 의 확보 및 번식 기술에 관한 연구가 지속해서 증가하고 있다 (Kim et al., 2019). 이에 따라 곤충 연구는 연구의 역사가 긴 초 파리, 누에, 모기뿐만 아니라, 산업적으로 활용도가 높은 딱정 벌레나 귀뚜라미 등의 새로운 산업 곤충을 활용한 기능성 소재 탐구와 미래 먹거리 개발로 연구 범위가 넓어지고 있다(Melgar- Lalanne et al., 2019).

    전통적인 산업 곤충인 누에(Bombyx mori)는 오래전부터 생 물적 특성과 번식력, 생존력 등을 향상시키는 등 지속적인 품종 개량이 이루어져 왔으며, 이에 따라 누에의 형태적, 물리적, 유 전적인 특성이 광범위하게 연구되어왔다(Kang et al., 2007;Kumari et al., 2011). 이와 같은 전통적인 교배육종을 통한 품종 개 량의 경우 실크 생산을 위한 생산성 및 품질 개선이 주요 목적 이었기 때문에 인공합성 섬유의 개발로 인하여 천연 실크에 대 한 수요가 감소하고 잠업이 쇠퇴함에 따라 전통육종 연구는 현 재 명맥만을 유지하는 실정이다. 하지만 최근에는 누에의 부가 가치를 높이기 위한 연구의 하나로 누에의 생체공장화에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 형질전환 누에를 이용하 여 바이러스 항체나 호르몬과 같은 산업적으로 가치가 높은 특 수한 단백질들을 선택적으로 생산하기 위한 연구들을 진행하 고 있다(Okano et al., 2000;Ueda et al., 1993).

    과거에는 곤충 형질전환이 초파리 및 모기를 이용한 유전자 의 기능 연구가 주를 이루고 있었으며(Rubin et al., 1982;Coates et al., 1998), 2000년대에 이르러 누에 형질전환을 위한 연구가 본격적으로 이루어지기 시작했으나(Tamura et al., 2000), 누에 는 기존 형질전환에 이용되던 초파리 및 모기와는 다르게 단단 한 난각이 존재해 어려움을 겪었다. 이에 따라 알을 고정하고 금속 바늘을 이용한 천공 작업 후 마이크로인젝션을 수행하는 기술이 개발되었지만 다른 곤충의 형질전환과 비교하여 작업 난도가 높고 효율과 작업속도가 매우 낮았다. 이후 누에 형질전 환을 보다 효율적으로 수행하기 위한 기술들이 개발되었으나 (Tamura et al., 2007), 가장 기본적인 마이크로인젝션(microinjection) 을 위한 알의 정렬 및 고정에는 변화가 없었다. 일반 적으로 한천 젤 위에 누에 알을 일렬로 정렬시킨 후 슬라이드 글라스에 고정하기 위해서는 핀셋으로 일일이 알들이 옮겨서 정렬해야 하므로 새로운 방법이 필요한 실정이다.

    최근 3D 프린팅을 이용한 기구 제작 기술이 발달하면서 비 교적 간단하게 필요한 도구를 소량 생산하고 이용할 수 있게 되 었다. 따라서 본 연구에서는 누에 알 정렬 및 고정 작업의 효율 을 높이고, 숙련자와 비숙련자의 차이를 좁히기 위하여 3D 프 린터를 이용하여 도구 제작 후 정렬 효율 검증을 통해 응용 가 능성을 검토하였다.

    재료 및 방법

    누에 알 준비

    모든 실험에는 휴면계통 보급 품종인 백옥잠(잠123*124)의 알을 사용하였으며, 누에 사육은 농촌진흥청 농업생물부의 표 준 사육 기준에 준하여 사육하였다. 25℃의 온도와 70-90% 습 도에서 신선한 뽕잎을 먹이로 공급하고 16L8D 조건으로 사육 하였다. 누에 알은, 25℃에서 비중 1.1의 염산 용액(20%)에 15 분 동안 담근 후, 20분간 흐르는 물을 이용하여 세척하고 건조 시켜 준비하였다.

    모델링 및 3D 프린팅

    도구 제작은 모두 CADian3D (INTELLIKOREA, South Korea)를 이용하여 모델링하고 Fusion360(Autodesk Inc., USA) 프로그램으로 3차원 화상을 제작하였다. 3D 프린팅 슬라이싱 (Sinterit sudio, Poland)으로 프린팅 조건 설정 후 Sinterit Lisa Pro (Poland)를 이용하여 프린팅을 진행하였고, 프린팅 소재는 나일론 수지인 PA12(Sculpteo, France)를 사용하였다.

    누에 알 정렬 및 고정

    알 정렬을 위하여 2% 한천 젤을 제작하고 알 배열판 위에 올 린 후 누에 알을 흩뿌려서 알 배열판의 두 줄의 각 공간에 누에 알이 배치되도록 하였다. 알을 정렬하고 알 배열판을 한천 젤에 서 제거하여 두 줄의 알 배열이 젤 위에 만들어지도록 했다. 준 비된 슬라이드 글라스에 접착제 줄눈판을 올려놓고, 목공용 접 착제를 Kovax-syringe 1 ml 주사기(Koreavaccine, South Korea) 를 이용하여 2개의 줄눈이 되도록 접착제 선을 긋고 정렬된 알 을 접착제 선이 그어진 슬라이드 글라스에 접착시키고, 한 줄에 15개의 누에 알을 네 줄로 접착하여 각 슬라이드 글라스에 총 60개의 부착하였다.

    작업시간 측정

    알 배열판과 접착제 줄눈판의 효율을 확인하기 위하여 작업 시간을 측정하는 실험을 진행하였다. 대조군은 핀셋과 한천 젤 및 슬라이드 글라스만을 이용하여 480개의 알을 부착하는데 소요된 시간을 측정하고, 실험군은 알 배열판, 접착제 줄눈판, 핀셋, 한천 젤을 이용하여 480개의 알을 부착하는 시간을 측정 하였다.

    마이크로인젝션

    마이크로인젝션 실험은 Tamura et al. (2007)의 실험 기구와 방식을 적용하여 수행하였다.

    통계분석

    알 정렬 및 고정 실험에 대한 결과는 평균값(Mean value) ± 표준오차(SE)로 나타내었으며, IBM SPSS Statistics 23(IBM, USA)를 이용한 일원배치 분산분석 (Oneway Analysis of Variance; ANOVA)을 실시하고, 각 평균값의 유의성(P < 0.05) 은 Duncan's multiple rage test를 실시하여 검정하였다.

    결과 및 고찰

    알 배열판 제작

    마이크로인젝션을 위한 준비과정 중 슬라이드 글라스에 누 에 알을 고정하기 위해서는 한천 젤 위에 알을 정렬시키게 되며, 이는 핀셋을 이용하여 일정한 간격으로 누에 알을 하나씩 집어 옮겨서 배열해야 한다(Fig. 1A). 이와 같은 문제점을 해결하고 자 누에 알을 정렬시킬 수 있는 홈을 가지고 있으며 한번에 두 줄의 정렬이 가능하도록 고안된 도구인 알 배열판를 제작하였 다(Figs. 1B, 1C, and 1D). 알 배열판은 슬라이드 글라스 크기에 맞게 제작된 15개의 홈이 두 줄로 구성되어 있어, 슬라이드 글 라스에 총 30개의 누에 알들을 한번에 정렬시킬 수 있는 것이 특징이다. 실제 크기가 작은 도구이기 때문에 사용이 용이하도 록, 알 배열판의 중앙에 손잡이로 사용할 수 있는 작은 판이 돌 출되어 있다. 또한 누에 알을 정렬시킨 후 알을 건드리지 않고 알 배열판을 한천 젤에서 쉽게 떼어낼 수 있도록 30°로 꺾인 뒷 판이 구성되어 있다. 누에 알들을 배열한 뒤, 뒷판을 살짝 누르 며 알 배열판을 들어 올리면, 배열된 누에 알들이 흐트러지지 않고 유지되며, 알 배열판을 젤에서 떼어낼 수 있게 된다. 또한 각 홈에 누에 알을 배치하고 알 배열판을 알 쪽 방향으로 밀어 서 배열을 완성시킬 때 알 배열판의 움직임이 용이하도록, 알 배열판 밑 판의 일정 부분이 한천 젤과 닿지 않는 구조로 되어 있다.

    제작된 알 배열판을 이용한 누에 알 정렬 작업은 한천 젤 위 에 알 배열판을 올려놓고, 30개로 구성된 각 홈에 누에 알이 들 어가도록 적당량의 알을 흩뿌린 후 알 배열판을 알 쪽 방향으로 살짝 밀어서 누에 알이 한쪽으로 밀리면서 정렬되도록 한다. 알 배열판의 중앙손잡이를 잡고 꺾인 뒷판으로 기울이며 한천 젤 에서 떼어낸다. 일렬로 배열된 누에 알을 실험에 맞게 핀셋으로 방향을 조정해주며, 채워지지 않은 칸이 있으면 누에 알을 옮겨 배치함으로써 누에 알 위치와 간격을 조정하기가 매우 용이하 게 되어 전체적인 실험 속도가 향상된다.

    접착제 줄눈판 제작

    누에 알에 유전자를 삽입하기 위해서는 누에를 정렬시키는 것뿐만 아니라, 정렬된 누에 알들을 슬라이드 글라스 위에 고정 시키는 작업이 필요하며, 일반적으로 슬라이드 글라스 위에 접 착제로 선을 그어서 그 위에 누에 알을 붙인다(Fig. 2A). 고정 과정의 편의성 향상을 위하여 슬라이드 글라스 위에 안정적이 고 빠르게 접착제로 선을 긋기 쉽도록 접착제 줄눈판을 제작하 였다(Figs. 2C, 2D, and 2E). 접착제 줄눈판은 슬라이드 글라스 를 고정할 수 있는 고정 홈이 밑부분에 존재하여, 접착제로 선 을 그을 때 슬라이드 글라스가 움직이지 않고 고정되도록 잡아 준다. 접착제 줄눈판은 알 배열판의 간격과 길이에 맞도록 제작 되었으며, 두 줄로 구성된 접착제 홈들로 슬라이드 글라스에 두 개의 접착제 선들을 한번에 그을 수 있도록 고안되었다(Fig. 2B). 또한 두 줄의 알을 슬라이드 글라스에 부착한 후, 나머지 3 번째, 4번째 접착제 선을 그을 때 문제가 되지 않도록 알 배열판 의 위 아래로 넓은 빈공간을 배치하였다(Fig. 2F).

    알 배열판의 및 접착제 줄눈판의 이용

    제작된 알 배열판을 이용하여 알을 정렬하고(Fig. 3A), 접착 제 줄눈판을 이용하여 마이크로인젝션을 준비하는 과정 중 알 고정 작업에 소요되는 시간을 분석하였다(Fig. 3B). 그 결과 6 개월 이상 이 작업을 했던 숙련자들의 경우 도구를 사용하지 않 는 시간에 비해 도구를 사용한 작업시간이 약18.6% 감소하였 다. 크기와 모양이 상이한 누에 알의 크기와 일치하는 홈의 크 기를 만들 수 없었으나, 누에 알들을 일렬로 정렬하고 한 방향 으로 밀어줌으로써, 일렬로 정렬이 되었으며 마이크로인젝션 을 원활하게 진행할 수 있었다. 일반적으로 도구를 사용하지 않 았을 때는 전체적으로 비뚤어지는 경향을 보이것과는 다르게 제작된 도구를 사용할 때 일직선의 형태로 알이 부착되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3C). 또한 작업자의 시간이 단축되고 효 율이 높아지면서, 작업 편의성 또한 개선되었다.

    이러한 결과를 종합해 볼 때 제작된 2종의 도구가 극적인 시 간 단축을 보이지는 못하였지만, 연구자의 고정 작업 편의성을 개선하고 마이크로인젝션을 위한 현미경 및 로봇 팔 조작을 유 리하게 하여 형질전환 작업의 준비 시간 단축 및 효율성에 효과 가 있음이 확인되었다. 이에 따라 제작된 도구가 누에 알(1 mm) 과 유사한 크기를 가지는 최근 각광받고있는 산업 곤충인 장수 풍뎅이 및 흰점박이 꽃무지 등 알(1~2 mm)의 분자육종 과정에 서도 이용할 수 있을 것으로 기대되며, 알의 배열 수 또는 조작 편의성을 개선할 수 있도록 추가적인 개량 및 연구가 필요할 것 으로 판단된다.

    사 사

    본 연구는 2021년도 농촌진흥청 공동연구사업(과제번호: PJ01622501) 및 국립농업과학원 전문연구원 과정 지원사업에 의해 이루어진 것임

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    The silkworm eggs line on agarose gel and the structure of the egg liner (EL). (A) Silkworm eggs have to be a line on agarose gel to attach on slide glass for microinjection. The red arrow is a silkworm egg. (B) Drawings of the of the EL design, (C) EL 3D modeling, and (E) EL 3D printing output with a row of 15 partitions, which facilitates the alignment of 30 silkworm eggs on a glass slide at a single time. The rising plate in the middle is the handle of the EL, and the back panel is bent at an angle of 30 degrees (red arrow).

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    The scheme of glue drawing on slide glass and the structure of the glue drawer (GD). (A) To attach eggs on slide glass, there should be a straight line drawn with glue. (B) Glue line using a syringe in the thin space in the middle of GD. (C) Drawings of the GD design, (D) GD 3D modeling, and (E) GD 3D printing output, which consists of two thin spaces in the middle and large empty spaces above and below, with a handle plate on one side. (F) When drawing the third and fourth adhesive lines, the two large empty spaces are constructed such that the first and second are already aligned and the fixed eggs are not disturbed.

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    The convenience and efficiency of the egg liner (EL) and the glue drawer (GD). (A) The silkworm eggs are initially placed at approximate positions in individual partitions of the EL, and are subsequently pushed to align more precisely. (B) The time taken to align eggs with and without the EL. The experiment assessed the time taken to align and anchor 480 silkworm eggs. (C) The degree of distortion when aligning eggs using tools or not. The error bars represent the standard error (SE) of three replicates and the asterisks denote significant differences with respect to the control (P < 0.05).

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