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ISSN : 1225-0171(Print)
ISSN : 2287-545X(Online)
Korean Journal of Applied Entomology Vol.61 No.1(Special Issue) pp.173-195
DOI : https://doi.org/10.5656/KSAE.2022.01.1.067

Molecular Action of Prostaglandin to Mediate Insect Immunity and Its Application to Develop Novel Insect Control Techniques

Yonggyun Kim*
Department of Plant Medicals, College of Life Sciences, Andong National University, Andong, 36729, Korea
*Corresponding author:hosanna@anu.ac.kr
December 30, 2021 January 28, 2022 February 4, 2022

Abstract


Like vertebrates, insects synthesize various eicosanoids after the committed catalytic step of phospholipase A2 (PLA2). However, the subsequent biosynthetic steps exhibit some deviation from those of vertebrates. Due to little composition of arachidonic acid in insect phospholipids, PLA2 releases linoleic acid, which is another polyunsaturated fatty acid and relatively rich in insect phospholipids, to synthesize arachidonic acid via chain extension and desaturation. Resulting arachidonic acid is then oxygenated into a prostaglandin (PG), PGH2, by a specific peroxidase called peroxynectin, but not by cyclooxygenase. PGH2 is then isomerized to various PGs such as PGA2, PGD2, PGE2, PGI2, and a thromboxane (TXB2). All four epoxyeicosatrienoic acids such as 5,6-EET, 8,9-EET, 11,12-EET, and 14,15-EET are also synthesized from arachidonic acid by oxygenation of vertebrate types of monooxygenases. However, the other type of eicosanoids called leukotrienes are found in insect tissues but their synthetic pathway is unclear. Eicosanoids mediate various insect physiological processes such as metabolism, excretion, immunity, and reproduction. Thus, identification of novel compounds interrupting eicosanoid biosynthesis would be a novel approach to develop insecticides. This review focuses on PGs and their immune mediation.



곤충 면역반응을 중개하는 프로스타글란딘의 분자적 기작과 해충방제 응용

김 용균*
안동대학교 생명과학대학 식물의학과

초록


척추동물과 유사하게 곤충도 인지질분해효소(phospholipase A2)의 촉매 작용으로 다양한 아이코사노이드를 합성한다. 그러나 일련의 아 이코사노이드 생합성과정은 척추동물과 차이를 보이는데, 이는 곤충의 인지질에는 전구물질인 아라키도닉산의 함량이 낮기 때문이다. 대신에 비 교적 풍부하게 존재하는 다가불포화지방산인 리놀레익산을 기반으로 사슬 연장 및 불포화반응으로 아라키도닉산을 합성하여 척추동물과 같이 아이코사노이드 전구물질로 이용하는 것 같다. 이렇게 해서 형성된 아라키도닉산은 다시 척추동물의 cyclooxygenase와 유사한 peroxynectin이 PGH2 형태의 프로스타글란딘(prostaglandin: PG) 전구물질을 형성하게 된다. 이후 여러 이성체 효소들의 특이적 반응에 의해 PGA2, PGD2, PGE2, PGI2, TXB2의 다양한 PG가 생성된다. 반면에 또 다른 형태의 아이코사노이드인 에폭시아이코사트리에노익산(epoxyeicosatrienoic acid: EET)은 척추동물과 유사한 단일산화효소의 산화반응으로 아라키도닉산을 전구물질로 5,6-EET, 8,9-EET, 11,12-EET, 14,15-EET를 형성하게 된다. 그러나 세 번째 아이코사노이드 부류인 류코트리엔(leukotriene)의 경우 곤충 체내 존재는 확인되었지만 생합성 과정은 아직 밝 혀지지 않았다. 이들 아이코사노이드가 곤충의 대사, 배설, 면역 및 생식에 관여하는 생리작용을 중개한다. 따라서 아이코사노이드 생합성 과정을 교란하는 물질 탐색은 새로운 살충제 개발 전략이 된다. 본 종설은 이 가운데 PG의 곤충 면역 중개 기작을 소개한다.



    인체의 전립선(prostate) 추출물이 자궁의 평활근을 수축시 키는 현상을 기초로 von Euler (1936)는 이 추출물에 프로스타 글란딘(prostaglandin: PG)이라는 생리활성 성분이 존재한다 고 추정하였다. 이후 Bergström et al. (1962)에 의해 PG의 화학 구조를 밝히게 되었으며 아울러 PG가 탄소수 20개의 아라키도 닉산(arachidonic acid: AA)에서 유래된다고 보고하였다. AA 는 류코트리엔(leucotriene: LT)과 에폭시아이코사트리에노익 산(epoxyeicosatrienoic acid: EET)의 생합성 과정에도 전구물 질로 이용된다. 이들 PG, LT 및 EET를 통칭하여 아이코사노이 드(eicosanoid)라 일컫는다. 이들 아이코사노이드의 화학구조 및 이들의 생합성 과정을 발견한 것이 추후 아스피린과 같이 인 체 및 가축의 질환을 치료하는 약물 개발에 기폭제가 되었기에 1982년 Bergström, Samuelsson 그리고 Vane은 공동으로 노벨 의학상을 수여받게 된다. 한편, 이들 아이코사노이드는 포유동 물은 물론이고 다양한 무척추동물의 생리현상도 조절한다 (Stanley, 2000).

    곤충에서도 이들 아이코사노이드가 다양한 생리 조절에 관 여하게 된다(Kim and Stanley, 2021). 특별히 다양한 PG가 여 러 곤충에서 발견되었고, 이에 대한 생합성 과정이 척추동물과 는 다소 차이를 보이면서 밝혀지고 있다. EET는 5,6-EET, 8,9-EET, 11,12-EET, 14,15-EET로 구성되고 이들 모두는 곤 충 체내에서 발견되었으며 이들의 곤충 체내에서 생합성 과정 및 생리 중개 기능이 밝혀졌다. LT의 경우 곤충 체내에서 정확 한 생합성 과정은 밝혀지지 않았지만, 면역을 비롯한 다양한 생 리 조절에 중요한 기능을 수행하고 있다. 따라서 이들 아이코사 노이드 생합성 과정을 교란하는 물질 탐색은 새로운 살충제 개 발 전략으로 주목을 받게 되었다.

    본 종설은 이들 아이코사노이드 가운데 PG를 중심으로 곤충 의 면역에 미치는 영향을 생리현상에서 내재하는 분자기작까 지 연결하여 정리하였다.

    곤충 면역

    곤충 면역 특징

    많은 곤충은 이들 주변에 다양한 미생물 및 기생체가 서식하 고 병원체에 쉽게 노출될 수 있다. 따라서 이들 병원체의 감염 에 대처하려는 면역반응은 곤충의 생존에 필수적이다. 척추동 물과 달리 곤충은 선천성 면역만을 갖추고 있다(Lemaitre and Hoffmann, 2007). 후천성 면역은 림프구 가운데 특수화된 B세 포에서 유래된 항체 및 세포독성 T세포의 활동으로 구성되며 특정 병원체에 특이적으로 반응하여 효과적 방어를 이루게 된 다. 그러나 이러한 후천성 면역을 발현시키기 위해서는 비교적 장기간의 시간이 소요되고 이는 척추동물에 비해 비교적 짧은 곤충 수명을 고려해 볼 때 결코 효율적 방어 수단으로 이용하기 어렵다. 즉, 후천성 면역 기작을 갖고 있더라도 곤충은 이를 효 과적으로 발현하는 데 필요한 소요기간 보다 자연 생존 기간이 짧을 수 있다는 것이다. 따라서 필연적으로 곤충은 진화 과정 속에서 게놈 상에 프로그램된 선천성 면역을 통해 예견된 병원 체 감염에 대처하는 수밖에 없다(Kim et al., 2018a).

    세포성 면역반응

    곤충의 선천성 면역은 세포성 및 체액성 면역반응으로 대별 된다. 세포성 면역반응은 주로 혈구세포에 의한 반응으로 혈강 으로 침입한 병원체에 대해서 수 분 내에 신속하게 반응하게 된 다(Strand, 2008). 이는 비교적 소형 침입자에 대해서 혈구세포 의 식균작용(phagocytosis)이 우선 고려되나, 이들의 침입자의 수가 많아지면 여러 혈구세포들의 분비물에 의해 침입자들을 묶어 작은 혹 모양을 만드는 소낭형성(nodulation)을 발휘하게 된다. 한편 내부기생봉 알과 같이 침입자의 크기가 혈구세포에 비해 상대적으로 큰 경우 이를 둘러싸서 침입자로 전달되는 영 양분 공급을 막고 다시 최종적으로 멜라닌형성 과정 동안 만들 어지는 독성물질의 분비로 침입자를 치사시키는 일련의 과정 을 피낭형성(encapsulation)이라 한다. 한편 바이러스 침입의 경우는 미리 프로그램된 세포자연치사과정인 아폽토시스(apoptosis) 도 이 세포성 면역 범주에 속할 수 있다(Clem, 2005).

    체액성 면역반응

    체액성 면역반응은 비세포성으로 멜라닌형성과 같은 독성 물질을 통한 화학반응 또는 항생단백질을 통한 침입자의 불활 화 및 병원체를 인식하고 이를 혈구세포로 연결하여주는 옵소 닌(opsonin) 반응도 포함한다(Kanost et al., 2004;Imler and Bulet, 2005). 침입한 미생물 주변으로 활성화된 페놀옥시데이 즈(phenoloxidase: PO)의 촉매반응으로 산화된 페놀 물질을 형 성하고 이들의 중합반응으로 멜라닌이 형성되는 데 이 산화과 정 동안 세포독성을 갖는 카테콜(catechol) 또는 퀴논(quinone) 물질이 형성된다(Zhao et al., 2007). 다양한 항생단백질이 병원 성 세균과 곰팡이 침입에 대해서 발현된다. 이들의 발현은 미생물 표면에 존재하는 병원체 특이적 분자구조(pathogen-associated molecular pattern: PAMP)를 인식하면서 미리 프로그램된 면역 신호 전달 과정이 가동된다. 즉, 혈장에 존재하는 패턴인식단백 질(pattern recognition receptor: PRR)이 주로 그람양성균 세포 벽에 존재하는 Lys-type peptidoglycan 구조 또는 곰팡이 표면 에 존재하는 β-1,3-glycan에 특이적으로 인식하는 PRR에 의해 Toll 면역신호를 가동시킨다. 반면에 그람음성균에 존재하는 DAP-type peptidoglycan에 반응하는 PRR이 IMD (Immune deficiency) 면역신호를 가동하게 된다. Toll/IMD 면역신호는 각각 특이적 전사인자를 활성화하여 이들에 의해 특이적 항생 단백질의 유전자 발현을 유도하게 된다. 증가된 유전자 발현은 각각의 항생단백질을 생산하여 혈장으로 방출하면 해당 병원 체에 특이적으로 반응하여 병원체의 불활화 및 세포독성 효과 를 주어 병원체를 제거하게 된다. 곤충에서 발현되는 항생단백 질은 라이소자임, 세크로핀 및 디펜신 등 다양하며, 또한 이들 항생단백질의 종류는 곤충마다 상이하다. 특별히 헤몰린(hemolin) 과 같은 면역 단백질은 병원체 인식 및 병원체와 혈구세 포 사이를 연결하여주는 옵소닌 반응에 관여한다(Jung et al., 2019).

    소화관 면역반응

    곤충의 소화관에는 다양한 미생물이 존재한다. 이들은 편리 공생자(commensal)와 같은 단순 거주자에서 적극적으로 기주 와 상리공생(mutualist) 관계를 유지하는 미생물까지 다양하다. 그러나 이 소화관은 먹이가 처한 환경 조건에 따라 다양한 병원 균의 감염에 노출될 수 있다. 따라서 곤충의 소화관은 이들의 미생물이 자신에게 유리한지 또는 해로운지를 분간할 필요가 있다. 해로운 병원 미생물 침입에 대해서는 곤충 소화관은 항생 단백질과 활성산소(reactive oxygen species: ROS)를 분비하여 방어하는 것으로 알려지고 있다(Lee et al., 2013). 그러나 이러 한 방어물질이 오히려 유리한 공생균과 곤충 자신에게 해가 될 수 있기에 이들의 발현 또는 생산을 철저하게 제어하고 있다. 예를 들어, IMD 신호를 통해 공생세균의 인식은 Caudal 억제 전사인자에 의해 항생단백질의 발현을 조절하게 한다. 또한 ROS의 생산은 dual oxidase (Duox)의 활성 조절에 의해 제한 되고 있다. 그러나 병원균의 감염에 따라 생존에 위협을 주게 되면 Duox가 활성화되어 소화관 내부로 ROS를 분비하여 병원 미생물을 제거하게 된다.

    면역 중개물질

    곤충 면역반응은 우선 PRR에 의한 침입 병원체의 인식으로 부터 가동되며(Fig. 1), 이 인식 신호는 자기분비(autocrine) 또 는 이웃분비(paracrine)로 작동하는 국부호르몬의 중개 역할로 이웃 세포 또는 주변 조직으로 전달된다(Gillespie et al., 1997). 이러한 면역중개자는 산화질소(NO), 아미노산 유도체인 모노 아민류(biogenic monoamines), 펩타이드성 사이토카인(cytokine) 그리고 지방산 유도체인 아이코사노이드(eicosanoid)를 포함 한다. 산화질소는 아미노산 알지닌으로 부터 산화질소합성효 소(NO synthase: NOS)의 도움으로 생합성된다(Rivero, 2006). 산화질소는 비극성으로 분자량이 적어 쉽게 세포막을 투과하 여 면역신호를 전달하게 된다. 모노아민류는 아미노산 타이로 신에서 유래된 옥토파민(octopamine: OA)과 아미노산 트립토 판에서 파생된 세로토닌(serotonine)을 포함한다(Baines et al., 1992). 곤충의 사이토카인으로 최초로 알려진 것이 PSP (plasmatocyte- spreading peptide)로서 과립혈구가 분비하며 부정형 혈구의 활착행동(spreading behavior)을 촉진한다(Clark et al., 1997). 아이코사노이드는 탄소수 20개를 갖는 다가불포화지방 산의 산화물로 주로 아라키도닉산에서 유래된 PG, LT 그리고 EET를 포함한다. 이들 모두는 다양한 병원체에 대해서 곤충의 세포성 및 체액성 면역반응을 중개한다(Kim and Stanley, 2021). 흥미로운 점은 이들 면역신호 중개물질들 사이에 신호교신 (cross-talk)이다. 모노아민의 경우 소낭형성과 같은 세포성 면 역을 중개하는 데 아이코사노이드 생합성 억제자를 처리하면 이러한 중개반응이 일어나지 않는다(Kim et al., 2009). 유사한 결과가 사이토카인에서도 일어나 PSP에 의한 혈구세포의 활 착행동 촉진이 아이코사노이드 생합성 억제자 처리에 의해 억 제된다(Srikanth et al., 2011). 산화질소도 항생단백질의 합성 을 촉진하는 면역 중개반응이지만, 아이코사노이드 생합성 억 제자를 처리하면 이 면역유도 반응이 억제된다(Sadekuzzaman et al., 2018). 이러한 중개물질 신호교신은 small G protein의 일종인 Rac1의 활성화에 의해 설명된다. 즉, 다른 중 개물질들이 모두 Rac1의 활성화를 유도하는데, 활성화된 Rac1 은 PLA2 효소활성을 촉진하여 다양한 아이코사노이드 생합성 을 유도하게 된다. 따라서 이 Rac1의 억제는 PLA2 활성화를 억 제하여 아이코사노이드 생성이 일어나지 않아 병원균이 침입 하여도 면역반응이 일어나지 않게 된다(Park et al., 2013). 여기 서 Rac1이 어떻게 PLA2를 활성화하는지에 대한 정확한 분자 기작이 밝혀지지 않았는데, 이는 아마도 척추동물의 모델에서 보듯, 세포질에 존재하고 있던 불활성 상태의 PLA2가 Rac1의 도움으로 활성화되어 이 효소의 기질인 생체막(주로 핵막)으로 자리이동하는 것(You et al., 2005)으로 추정된다. 즉, GTP와 결합한 Rac1이 p38 kinase를 활성화하여 PLA2의 특정 부위 인 산화를 통해 세포내 자리이동을 야기하였을 것으로 이해된다. 이 부분에 대해서 향후 연구가 필요하다. 이상의 면역 중개자들 의 상호교신은 아이코사노이드가 곤충 면역 중개의 중추적 역 할을 담당하고 있다는 것을 의미한다.

    곤충 PG 다양성과 생합성과정

    PG 다양성

    생합성 과정에서 전구물질 PGH2는 5각형 고리 모양의 구조 를 가지고 있지만, PGI2는 또 다른 5각형 고리를 추가하면서 prostacyclin으로 세분류된다. 또 다른 변형은 트롬복산(thromboxane: TXA2 또는 TXB2)으로 6각형 고리 모양으로 변형되어 prostanoid 범주에 들어가게 된다. 엄밀히 말하면 전체는 prostanoid 범주이고 여기에 프로스타글란딘, prostacyclin 그 리고 트롬복산으로 분류하게 된다. 여기서는 간편하게 모두를 PG로 통칭한다. 다양한 PG가 곤충에서 발견되고 있다(Table 1). 최근 이들의 화학 동정은 GC-MS 또는 LC-MS/MS를 이용 하여 용이하게 분석되고 있다. 일부 곤충의 경우 PGE2 체내 함 량 측정에 방사항체면역분석법을 이용하기도 하였다. 따라서 분석 대상 PG를 미리 전해 놓고 동정되었기에 실제로 충체 내 에 존재하는 PG는 더욱 다양할 수 있다. 현재까지 곤충 체내에 서 동정된 PG는 7종류로서 PGA2, PGD2, PGE2, PGF, PGG2, PGI2, TXB2를 포함하고 있다. 여기서 PGE2는 분석된 곤충 모 두에서 검출되었다. 파밤나방(Spodoptera exigua)의 경우 이들 PG의 검출 함량은 조직에 따라 다소 상이하게 나타나지만 모 든 조직에서 가장 많은 양으로 검출된 PG는 PGF로서 1.2~2.6 pg/g으로 존재한다(Kim et al., 2020).

    PG 생합성 시작단계로서 인지질분해효소

    프로스타글란딘을 합성하기 위해서 우선 아라키도닉산이 초기 생합성 전구물질로 필요하다. 아라키도닉산은 탄소수 20 개에 4개의 이중결합(카르복실기로부터 5, 8, 11, 14번째 탄소) 을 포함한 다가불포화지방산이다. 인지질의 글리세롤 골격에 서 sn-2 위치에 있는 지방산이 주로 아라키도닉산이기에 이를 글리세롤 골격에 연결하는 에스테르결합을 선택적으로 분해할 수 있는 인지질분해효소(phospholipase A2: PLA2)의 촉매작용 이 요구된다. 즉, PLA2는 아이코사노이드 생합성의 첫 단계를 촉매하는 효소이다. 이 효소활성 조절은 아이코사노이드 전체 생합성 속도를 조절할 수 있다. 초기에 알려진 PLA2는 뱀(snake) 독샘물질에서 발견되었으며, 이 PLA2 내부에는 여러 이황화결 합으로 이 효소 단백질을 보다 안정화시키고 있다(Davidson and Dennis, 1990a,b). 유사한 구조가 포유동물 소화기관에서 발견되었다(Kramer et al., 1989;Seilhamer et al., 1989). 이후 이황화결합이 없고 분비형이 아닌 세포 내부(intracellular) PLA2가 발견되면서 이들 PLA2 단백질들의 분류가 필요하게 되었다(Dennis, 1994). 다양한 생명체에서 기원한 다양한 PLA2 단백질은 아미노산 서열을 기초로 최소 16개 그룹(I-XVI 그룹) 으로 분류되는 데, 전통적으로 이를 크게 5개의 부류로 통칭하 여 부르게 된다(Vasquez et al., 2018). 즉, 분비형 PLA2 (sPLA2: I-III, V, IX-XV 그룹), 세포내 칼슘 의존적 PLA2 (cPLA2: IV 그룹), 세포내 칼슘 비의존적 세포내 PLA2 (iPLA2: VI 그룹), 지질단백질 연계 PLA2 (LpPLA2: VII-VIII 그룹), 그리고 지방 세포 PLA2 (AdPLA2: XVI 그룹)로 대별된다. sPLA2와 LpPLA2 는 분비형이고 세포 밖 생체막 인지질에 작용하는 반면 cPLA2 와 iPLA2는 세포 내부 인지질에 작용하게 된다. 그러나 LpPLA2 와 AdPLA2의 작용 부위는 아직 확실하지 않다.

    잘 알려진 곤충의 PLA2는 꿀벌(Apis mellifera) 독샘물질에 포함된 sPLA2로서 III 그룹에 포함된다(Dudler et al., 1992). 또 다른 III 그룹의 sPLA2가 노랑초파리(Drosophila melanogaster) 에서 보고되었다(Ryu et al., 2003). 그러나 곤충의 면역과 연계 되어 보고된 최초의 PLA2는 거짓쌀도둑거저리(Tribolium castaneum)에서 발견되었다(Shrestha et al., 2010). 이러한 발 견은 초파리의 sPLA2 유전자 서열을 기반으로 거저리 곤충 게 놈에서 총 5개의 sPLA2 염기서열을 추정하고, 이들이 실제로 충체 내에서 발현하는지를 혈구세포를 비롯한여러 조직에서 RT-PCR로 확인하여 보고하였다. 이들 5개의 sPLA2 유전자가 효소의 기능을 발휘하는 지를 분석하기 위해 각각의 유전자들 모두를 대장균에서 발현시켰다. 이후 분리된 재조합 PLA2 단 백질을 기반으로 특이적 효소 활성을 확인하였다. 또한 이들 PLA2들이 면역기능과 연계성을 규명하기 위해 RNA 간섭 기 술을 통해 이들 sPLA2 유전자 각각의 발현을 억제한 후 면역반 응(=소낭형성) 저하를 분석한 결과 1개의 유전자를 제외하고 나머지 4개의 sPLA2가 면역에 관여한다는 것을 밝히게 되었다.

    이상의 거저리 연구를 시작으로 면역작용에 관련된 보다 다 양한 PLA2가 파밤나방에서도 알려졌다. 이 곤충의 전사체에서 1개의 sPLA2 유전자를 추정하였다(Vatanparast et al., 2018). 총 194개 아미노산으로 구성된 파밤나방의 sPLA2는 signal peptide, 칼슘결합부위 그리고 효소활성부위로 구성된 전형적 분비형 PLA2 모습을 지니고 있다(Fig. 2). 또한 이 파밤나방의 sPLA2는 전체 16개 그룹의 PLA2 유전자군 가운데 III 그룹에 속하고 있다. 이 III 그룹은 꿀벌 독샘물질에 포함된 sPLA2와 함께 거의 모두 곤충의 sPLA2로 구성된다. 흥미롭게도 이 III 그룹에서 독샘물질 유래 sPLA2와 면역 기능 관련 sPLA2 사이 에는 분자 구조 차이를 보여 같은 그룹이지만 구분이 가능하다. 이 sPLA2의 면역기능은 RNA 간섭을 통해 진행되었으며, 이 유전자의 발현을 억제시키면 세포성 면역반응이 크게 줄어 이 sPLA2가 면역 관련성을 입증하였다. 흥미로운 점은 이 RNA 간섭은 또한 파밤나방 유충의 발육을 억제하여 높은 유충 치사 율 및 번데기의 체중을 현격하게 감소시켰다. 즉, 이 sPLA2는 면역은 물론이고 발육에도 관여하는 것으로 이해된다. 파밤나 방의 sPLA2는 혈장에 존재하는 데 병원체의 감염이 없을 때에 도 비교적 높은 농도로 존재하고 있다(Vatanparast et al., 2019). 이에 대한 궁금증 풀기 위해 이 유전자를 대장균을 이용하여 발 현시켰다. 분리된 재조합 sPLA2는 0.5 mM 이상에서 세포독성 을 보였는데, 이보다 낮은 농도에서 곤충병원세균들에 대해서 높은 항생능력을 보였다. 이러한 결과는 비감염상태에서도 혈 장에 비교적 높은 농도로 sPLA2를 가지고 있었던 것이 병원체 감염에 대한 미리 예방차원으로 해석된다. sPLA2가 파밤나방 의 발육에 영향을 준 것은 이 효소의 지질 소화 기능에서 해석 될 수 있다. 이러한 이유는 척추동물과 달리 곤충은 쓸개즙을 가지고 있지 않아 지질소화에 대한 궁금증을 갖고 있었는데, sPLA2의 촉매반응의 부산물이 쓸개즙의 역할을 할 것이라는 가설을 세웠다. 즉, 중장 내강으로 분비되는 sPLA2는 인지질 분 해 이후 파생되는 lysophospholipid가 비누화물질로 작용하면 서 마치 척추동물의 쓸개즙과 같이 중성지질과 수용액 사이의 경계를 이루면서 라이페이즈(lipase)와 같은 지질 소화효소를 중성지질과 만나게 할 수 있게 한다. 실제로 중장에서 sPLA2의 효소활성 억제 또는 RNA 간섭은 파밤나방 소화에 영향을 주어 소화효율을 낮추어 유충 발육을 둔화시켰다(Sajjadian et al. 2019a). 즉, sPLA2의 기능은 면역뿐만 아니라 곤충의 소화작용 에도 관여한다.

    파밤나방 전사체 분석은 추가적으로 두 개의 PLA2가 더 존 재한다는 것을 제시하였다(Fig. 2). 이 두 PLA2는 VI 그룹에 속 하는 iPLA2로 분류되고 iPLA2-A (Park et al., 2015)와 iPLA2-B (Sadekuzzaman et al., 2017a)로 명명되었다. 이들은 모두 iPLA2 에 특징적인 patatin 영역을 지니고 있다. Patatin은 뉴클레오타 이드 결합부위(GxGxG)와 라이페이즈 보존영역(GxSxG)을 가 지며 이들 사이에는 약 10-40개 아미노산 간격을 두게 된다 (Wolf and Gross, 1996). iPLA2-A는 여기에 N 말단 부위에 단 백질 사이에 결합을 유도하는 ankyrin (ANK) 영역이 6개 반복 된다. 재조합 iPLA2-A는 칼슘 제거제인 5 mM EGTA 처리에 서도 효소활성을 유지하여 이 효소활성이 Ca2+ 농도와 관계없 이 일어난다고 증명하였고, iPLA2에 특이적 억제자인 bromoenol lactone에 의해 억제되어 이 효소가 전형적인 iPLA2라 는 것을 실험적으로 보여주었다. 또한 Sf9 세포주에 일시발현 을 유도한 결과 이 단백질이 세포질에 존재하는 것을 관찰하여 세포내 단백질이라는 것을 확인하였다. 한편 iPLA2-B는 N 말 단에 ANK 영역을 갖지 않는 짧은 분자구조를 지닌다. 두 iPLA2는 모두 면역반응과 연계되지만, iPLA2-B는 추가하여 생 체막 인지질의 손상을 복원하여주며, 또한 생리적 상태에 따라 생체막 지질 구성의 변화를 주는 항상성 조절에 관여할 것으로 추정되고 있다.

    아라키도닉산 생합성 과정

    척추동물은 생체막에 비교적 높은 농도로 아라키도닉산을 함유하고 있다. 예를 들어, 인체 근육세포의 경우 인지질 성분 가운데 아라키도닉산이 평균 13.1%를 차지하게 된다(Borkman et al., 1993). 그러나 특히 육상 곤충의 경우 체내 생체막에 는 아라키도닉산이 매우 낮은(0.05% 이하) 함량으로 존재한다. 반면에 파밤나방의 경우 지방체의 인지질에 리놀레익산(18:2) 과 리놀레닉산(18:3)이 32.6%와 27.0%를 각각 차지하고 있다 (Kim et al., 2016). 따라서 PLA2가 생체막을 기질로 아라키도 닉산을 방출하기 보다는 리놀레익산을 방출하여 elongase를 통 한 사슬 연장 및 △5 및 △6 desaturase의 불포화반응으로 아라 키도닉산을 생합성하는 것으로 밝혀졌다(Hasan et al., 2019). 이러한 과정을 뒷받침하듯, 파밤나방의 경우 비감염시 아라키 도닉산이 검출되지 않지만, 세균 감염 이후 아라키도닉산이 인 지질 함량의 0.195% 차지하였다(Kim et al., 2016). 이와 더불 어 감마리놀레닉산(18:3)과 eicosadienoic acid (20:2)가 검출 되어 아라키도닉산의 생합성이 ω-6 과정을 따라 진행되고 있 는 것을 추정하였다. 곤충이 왜 아라키도닉산 및 다른 다가불포 화지방산을 적게 갖는지에 대해서는 아마도 곤충 자체의 기원 이 고생대이고 그 당시 현재(21%)에 비해 높은(35%) 산소 분 압 조건에서 활성산소에 의한 다가불포화지방산의 유해성을 줄이기 위한 생존 전략으로 추정된다(Stanley and Kim, 2020). 활성산소에 의한 지질산화가 다가불포화지방산에서 일어나며 지질과산화(lipid peroxidation)를 야기시키는데 이를 통해 각 종 질병을 유발한다(Tyurina et al., 2008). 화랑곡나방(Plodia interpuctella)의 경우 활성산소를 방출하는 이산화염소(ClO2) 에 노출되면 생체막의 지질과산화로 치사하게 되는 데 이를 막 기 위해 이 곤충의 iPLA2가 산화된 지방산을 찾아 제거하는 생 체막 치유 기능이 알려졌다(Han et al., 2017). 따라서 고생대 시 기의 높은 산소 조건에서 아라키도닉산의 부재는 곤충에게 오 히려 생존에 유리함을 주었을 것으로 추정된다.

    PGH2 생합성

    척추동물과 달리 곤충에서는 필요에 따라 아라키도닉산을 합성하는 데, 이는 다시 척추동물의 cyclooxygenase (COX)와 유사한 peroxynectin (Pxt)의 촉매작용으로 PGH2 형태의 프로 스타글란딘 전구물질을 형성한다. 이를 뒷받침하듯, 세균 감염 이후 파밤나방의 인지질 함량 변화를 LC-MS/MS로 추적하였 다(Kim et al., 2020). 이 분석 결과는 PGG2의 존재를 확인하였 다. 척추동물의 경우 PGG2는 아라키도닉산이 COX에 의해 2 개의 산소 분자를 받아 형성된 중간대사물질이다. 이후 다시 COX 효소의 도움으로 라디칼 형태의 산소분자 1개를 떨어뜨 리면서 PGH2로 전환된다. 그러나 곤충 게놈은 COX의 상동유 전자(ortholog)를 갖고 있지 않다. 한편 PGE2의 또 다른 생리적 기능이 초파리의 생식과정에서 일어나는 데 여기에서는 PGE2 가 난모세포(oocyte)의 형성과정에 중요한 역할을 담당한다. 즉, 난모세포가 줄기세포에서 분화할 때 4번의 체세포 분열을 거쳐 16개의 세포로 전환되면 여기서 하나의 세포가 난모세포 가 되고 나머지 15개 세포는 영양세포(nurse cell)로 분화한다. 이후 난모세포가 비대해지면서 결국 영양세포는 난모세포에 흡수되는 nurse cell dumping (영양세포이탈) 현상이 일어난다. 이때 영양세포와 난모세포 사이에는 세포골격의 변화를 이뤄, 이를 통해 영양세포가 난모세포로 빠져 들어가게 된다. 이 과정 에서 중요한 내분비 신호가 PGE2가 해당된다. 아이오와대학교 의 Tootle 교수는 이 과정에서 COX와 유사한 기능을 하는 peroxynectin (Pxt)를 찾았다(Tootle and Spradling, 2008). 실 제로 이 유전자를 게놈에서 제거하면 영양세포이탈이 일어나 지 않는다. 이 돌연변이체에 인체의 COX 유전자를 추가하여 주면 다시 영양세포이탈이 회복된다. 이 연구 결과는 Pxt가 곤 충의 COX로서 작용한다는 것을 의미하였다. 이러한 연구를 기 반으로 파밤나방에서 Pxt 유사체를 전체 peroxidase (POX)를 중심으로 스크리닝한 결과 두 개의 POX-F and POX-H가 유사 한 기능을 한다는 것을 알게 되었다(Park et al., 2015). 곤충의 COX 유사 유전자는 모기류에서도 확인되었다. 학질모기(Anopheles gambiae)의 중장은 말라리아 원생동물의 감염에 대해 서 PGE2를 생성하고 면역 방어작용으로 혈구세포의 분화를 촉 진하게 된다(Bartletta et al., 2019). 이 과정에서 중장세포는 파 밤나방에서와 같이 두 개의 POX 효소(여기에서는 heme을 대 변하기 위해 heme peroxidase (HPX))인 HPX7과 HPX8이 COX로서 작용한다고 밝혔다. 파밤나방과 모기류에서 발견된 두 개의 POX는 아마도 척추동물의 COX가 두 개의 활성부위 를 지니고 있다는 점에서 이들 두 Pxt가 순차적으로 촉매작용 을 진행할 것으로 추정된다. 추후 이들 Pxt을 분리하여 기내조 건에서 아라키도닉산을 기질로 PGH2 생합성을 확인하여 볼 필 요가 있다.

    다양한 PG 이성체 생합성

    PGH2는 다양한 PG의 전구체로 작용한다. 이 이후의 단계는 주로 이성체 형성 효소의 도움으로 진행된다(Fig. 3). 예를 들 어, PGH2에서 PGE2로 전환은 PGES (PGE2 synthase)의 촉매 작용으로 진행된다. 특히 이 효소는 Sigma 부류의 glutathione transferase로서 효소활성부위에 Asn95-Asp96-Arg98의 세 아미 노산이 전자전달계를 이루면서 PGH2에서 PGE2로의 이성체를 유도하게 된다. 파밤나방의 경우는 Asn이 Ser으로 대체되면서 Ser-Asp-Arg의 전자전달계를 이루게 된다(Ahmed et al., 2018). 한편 최근 누에(Bombyx mori)에서 PGES와 기질이 결합한 상 태의 분자결정 구조를 밝히면서 활성부위에 Tyr107, Val155, Met159, 및 Glu203 아미노산들이 기질과 결합하는데 관여하는 것을 구조적으로 추정하였고, 이를 다시 각각의 site-directed mutagenesis를 통해 입증하였다(Yamamoto and Hirowatari, 2021).

    유사하게 PGD2 synthase (PGDS)와 PGI2 synthase (PGIS) 의 이성체 효소들의 특이적 반응에 의해 PGD2와 PGI2를 각각 형성한다. 파밤나방의 PGDS는 인체 PGDS와 32.8%의 아미노 산 서열 상동성을 보였으며 파밤나방의 PGES와는 동일한 Sigma 부류의 glutathione transferase이지만 상호 분자계통학 적으로 차이를 갖는다(Sajjadian et al., 2020). PGDS의 유전자 발현에 RNA 간섭을 유도하면 면역뿐만 아니라 발육과 생식에 영향을 주었다. 한편PGI2는 다른 PG와 달리 면역억제인자로 작용하였다(Ahmed et al., 2021). 세포성 면역반응인 소낭형성 으로 분석한 결과 PGI2 처리 농도에 따라 면역반응의 세기가 줄 었다. 흥미로운 사실은 PGI2를 생성하는 PGIS이 발현 시간이 PGES 보다 늦은 시간이 일어난다. 궁극적으로 PGI2의 양은 감 염충에서 4배 이상 증가하지만, 이러한 증가 시간대가 늦게 이 뤄져 이미 PGE2 또는 PGD2가 급격하게 올라 면역을 중개한 이 후에 PGI2의 증가가 이뤄져 면역 반응 후반기에 과도하게 유지 되어 있었던 면역반응을 줄여 원상태로 되돌리는 생리적 회복 현상으로 이해된다. 실제로 발현벡터에 재조합된 PGES 유전 자를 파밤나방 충체에 주입하여 in vivo transient expression을 실시하여 체내 PGE2 생성을 올린 실험을 진행한 결과 PGE2 과 도에 따른 발육 및 생식에 있어 적응도 감소가 발생하여, 과도 한 면역반응이 오히려 유해하다는 것을 입증하였다(Ahmed et al., 2019).

    전형적 PG 골격에서 차이를 보이며 prostanoid로 알려진 트 롬복산이 곤충에서는 최초로 파밤나방에서 발견되었다(Al Baki et al., 2021). 트롬복산은 두 종류로서 TXA2와 TXB2로 존 재하며, 활성화된 물질이 TXA2로서 TXB2는 비활성화된 대사 체로 간주된다. 인체를 비롯한 포유동물에서는 트롬복산이 혈 액 응고에 관여하여 혈관 수축을 통해 감염부위로 혈류량을 감 소시키고 혈소판의 이동을 증가시키게 한다(Braune et al., 2020). 파밤나방에서 TXA2는 발견되지 않지만 TXB2가 혈구세포에 서 약 300 ng/g의 높은 농도로 검출되었다. 아마도 TXA2는 불 안정한 물질이라 검출단계에서 TXB2로 전환되었을 것으로 본 다. 흥미롭게도 TXA2와 TXB2 모두는 곤충에서 생리적으로 활 성을 보였다. 트롬복산 생합성은 cytochrome P450 monooxygenase (CYP)의 일종으로 초파리에서 인체와 유사한 thromboxane synthase (TXAS)가 생물정보학 기술로 추정하였다 (Scarpati et al., 2019). 이를 바탕으로 파밤나방에 존재하는 139개의 CYP 유전자를 대상으로 유사한 유전자를 추정한 결 과 파밤나방 게놈에서 TXAS를 얻었다. 이 유전자 발현의 RNA 간섭 처리는 면역중개 기능을 잃게 하였고, 다시 TXA2 또는 TXB2를 추가하면 회복되어 이 유전자가 트롬복산 생합성에 관 여하는 것을 밝히게 되었다. 트롬복산이 곤충에서도 혈구의 이 동에 관여하는지를 분석하였다(Roy et al., 2021). 이동성이 있 는 혈구는 세포내 Ca2+ 신호를 보였다. 트롬복산 처리는 혈구의 Ca2+ 신호를 증가시켰다. 혈구의 움직임을 실시간을 관찰한 결 과 트롬복산의 생합성을 억제하는 경우 이러한 혈구 이동이 감 소하였다. 이러한 트롬복산에 의해 유기되는 Ca2+ 신호는 혈구 세포에 존재하는 트롬복산 수용체에 의해 유기될 것이다. 그러 나 곤충의 게놈에는 척추동물의 트롬복산 수용체 상동유전자 가 존재하지 않는다. 이러한 트롬복산 특이적 수용체는 없지만, PGE2 수용체가 트롬복산의 신호를 전달하여주는 것 같다. 이 러한 사실은 곤충에 있어서 PGE2 수용체의 리간드가 복수라는 것을 의미한다. 그러나 동일한 수용체가 복수의 리간드와 결합 하는지 아니면 이 PGE2 수용체 전사체의 교호 인트론제거 (alternative splicing)를 통한 변이체 PGE2 수용체가 존재하는 지는 아직 확인되지 않았다.

    과도한 면역반응은 오히려 에너지 효율이나 궁극적으로 생 명에 위협을 주기 때문에 PG 생합성의 철저한 조절이 필요하 며 아울러 PG 분해를 담당하는 대사과정이 필수적으로 동반되 어야 한다. 파밤나방을 중심으로 두 가지 대사효소인 PG dehydrogenase (PGDH)와 PG reductase (PGR)가 발견되었다(Ahmed and Kim, 2020). 이들 대사 효소들의 유전자 발현은 면역 처리 이후에 증가하지만, 생합성 효소인 PGES 또는 PGDS의 발현 이후 시점에서 일어났다. 또한 이들 대사 유전자의 발현이 세균 감염 없이도 프로스타글란딘류(PGE2 또는 PGD2) 만을 주입하 여도 일어나지만, 또 다른 아이코사노이드인 류코트리엔(LTB4) 을 주입하면 일어나지 않아 PG에 선택적으로 발현되는 것을 알 수 있다. PGDH 또는 PGR 유전자 발현을 RNA 간섭으로 억 제할 경우 PG의 대사가 일어나지 않아 비병원성 세균의 감염 에도 과도한 면역반응으로 치사에 이르게 할 수 있다. 이러한 현상은 PGDH 또는 PGR이 면역중개자인 PG의 대사에 중요한 기능을 수행한다는 것을 뒷받침한다.

    PG의 곤충 면역과정 조절 기작

    PG가 관여하는 곤충면역반응

    PG의 세포성 면역 반응 중개

    세포성 면역반응의 주체는 혈구이다. 이들 혈구는 조혈기관 (hemopoietic organ)에서 생성되는데, 초파리의 경우 림프기관 (lymph organ)이라 부르며 등쪽의 등핏줄 말단에 위치한 대동 맥의 개구부에 이 기관이 존재하여 혈림프가 등핏줄을 통해 빠 져나올 때 생성된 혈구가 혈강으로 배출되도록 한다. 반면에 나 비목 유충의 경우는 중흉과 후흉에 존재하는 날개 성충아조직 (wing disc) 주변에 위치한다. 이곳에서 새로운 혈구를 생성하 여 혈림프 순환을 따라 몸 전체로 분배된다. 그러나 새로운 혈 구세포의 생성은 약 20시간 이상 소요되는 체세포분열이 일어 나야 하기에 병원균 침입에 따른 긴급한 상황에서 이들 조혈기 관으로 부터 새로운 혈구 공급을 기대하기는 어렵다. 파밤나방 의 경우 혈강에 존재하는 혈구는 위치에 따라 크게 두 종류로 나뉜다. 하나는 혈장에 존재하는 순환형 혈구(circulatory hemocyte) 와 체벽에 붙어 있는 정주형 혈구(sessile hemocyte)로 대 별된다. 따라서 병원균 침입에 따라 빠른 시간에 혈구를 동원하 기 위해서는 이들 정주형 혈구를 순환형으로 전환할 필요가 있 다. 여기에 관여하는 인자가 PG로 알려졌다(Park and Kim, 2012). 실제로 병원균 침입 없이 PGE2만 주입하여도 순환형 혈 구수를 증가시켰다.

    증가된 혈구는 병원미생물 감염부위로 이동해야 하는 데 이 러한 혈구의 이동 방향성에 PG를 포함한 아이코사노이드가 관 여하는 것으로 알려졌다(Merchant et al., 2008). 이 연구는 Boyden chamber를 이용하여 투과막을 사이로 액체 공간을 양 분하고 한쪽 공간에 세균 유래 주화성 펩타이드인 fMLP (Nformyl- Met-Leu-Phe)를 처리하여 이곳으로 이동하는 혈구세 포를 계수하게 하였다. 이때 아이코사노이드 생합성을 유도하 는 PLA2에 대해서 특이적 억제물질인 데사메타손(dexamethasone) 을 처리한 혈구의 경우 방향성을 잃게 되었다. 반면에 PLA2의 촉매 생성물인 AA를 추가하여 주면 다시 혈구활동이 재개되어 이러한 혈구 이동성이 아이코사노이드에 의해 야기 되는 것임을 확인하여 주었다. 이러한 현상은 PG 생합성 억제 물질을 처리하였을때에도 일어나, PG가 혈구를 감염 병원체로 이동하는 데 필요한 화학주성을 야기시키며 일종의 케모카인 (chemokine)으로 작용한 것으로 해석된다. Phelps et al. (2003) 은 이러한 혈구의 응집을 in vitro 조건에서 관찰하였고, 아이코 사노이드 가운데 PG만이 이러한 행동을 유발한다고 관찰하여 PG의 케모카인 기능을 뒷받침하고 있다.

    대상 병원미생물에 도착한 혈구세포는 식균작용 또는 소낭 형성 및 피낭형성을 통해 병원체를 무력화하게 된다. 이때 필요 한 혈구행동이 바로 혈구활착행동(hemocyte-spreading behavior) 이다(Lavine and Strand, 2002). Miller (2005)는 이 혈구 행동 이 아이코사노이드에 의해 야기된다고 보고하였다. 이 혈구활 착행동은 크게 두 가지의 세포 구조가 변경이 필요하다(Fig. 4). 하나는 세포내 골격구조 변화로 G-액틴이 F-액틴으로 중합반 응(polymerization)이 일어나 미세섬유를 연장하는 과정과 여 러 미세섬유를 결속(bundling)하는 미세섬유 골격구조 변경을 포함한다. Profilin과 Arf GTPase와 같은 액틴 중합반응 인자들 과 fascin과 같은 결속 인자가 각각 관여하게 된다. 이들 액틴 관 여 인자들은 또 다른 small GTPase로 알려지는 Cdc42에 의해 활성화되는데, 이 Cdc42가 PGE2에 의해 조절되는 것이 파밤나 방 혈구세포에서 밝혀졌다(Ahmed and Kim, 2019). 반면에 cofilin과 같이 F-actin 분해인자는 반대의 결과를 주어 혈구세 포 활착행동 조절에 액틴 관여 인자들이 작동하고 있다는 것을 반증하여 주었다. 물론 성충의 난모세포 성숙 과정에서 PGE2 는 fascin에 작동하는 것으로(Groen et al., 2015) 이들 액틴 기 반 세포골격 재구성에 PG의 중개작용이 필수적으로 보인다.

    혈구활착행동을 유발하기 위해 또 다른 생리현상은 활착되 는 방향으로 세포질 크기 변화를 위해 세포 부피의 증가가 수반 되는데 이때 부피 증가를 위해 국부적으로 수공단백질(aquaporin: AQP)을 통한 물의 이동을 촉진시키는 세포활성이 요구 된다. AQP은 세포막에 위치한 내재성단백질로서 tetramer로 기능하는데 각 단위체의 종류는 척추동물에서 13개 유전자군 (AQP0-AQP12)으로 보고되고 있다(Ishibashi, 2006). 곤충의 경우는 6종류가 존재하는 이 가운데 물만 통과시키는 종류를 DRIP (Drosophilaintrinsic protein) 유전자군으로 구별된다. 파밤나방 혈구세포에서 발현하는 AQP이 DRIP 유전자군에 속 한다(Ahmed and Kim, 2019;2021). 이 AQP은 주변 이온 조성 에 따라 활성을 달리하게 되는 데 예를 들어, 저장액에 놓이면 물분자를 세포 내로 이송하여 세포 부피를 증가시키게 된다. 이 러한 AQP의 활성이 PGE2에 의해 조절되어 PG 생합성을 억제 하게 되면 혈구세포가 물분자 이동 능력을 상실하게 된다. 따라 서 PG는 혈구세포의 골격 및 AQP 활성을 모두 조절하여 혈구 활착행동을 유기하게 된다.

    소낭형성 및 피낭형성을 위해서는 혈구활착은 물론이고 멜 라닌형성이 일어나야 한다. 멜라닌형성은 타이로신 아미노산 유도체들이 페놀옥시데이즈(phenoloxydase: PO)의 촉매반응 에 의해 다양한 카테콜 또는 퀴논물질을 만들고 이들의 중합반 응에 의해 유도되기에 PO 효소의 활성화가 조절 대상이 된다 (Kanost et al., 2004). 왜냐하면 무절제한 PO 활성화는 오히려 곤충 자체에 독성물질로 작용하여 자가독성 피해를 유발하기 때문에 이 효소의 활성화를 철저하게 통제하여야 한다. 따라서 이 효소는 비활성 상태의 프로페놀옥시데이즈(proPO)로 생성 되어 혈장에서 다양한 세린계 단백질분해효소에 의해 활성화 되게 된다. 활성화 단계는 포유동물의 혈소판 활성화같이 단백 질분해에 의한 효소활성화가 진행된다. 이 과정에 관여하는 단 백질분해효소가 여러 곤충에서 잘 알려지고 있다(Jiang and Kanost, 2000). poPO는 주로 혈구세포에서 합성되는데, 파밤 나방의 경우 전적으로 편도혈구(oenocytoid)가 담당하게 되며 이는 초파리의 결정세포(crystal cell)에 해당된다. 파밤나방이 생성하는 proPO는 혈장으로 분비되기 위한 분비신호가 존재 하지 않아 혈구세포의 세포질에 축적되어 있다. 따라서 병원체 감염에 따라 멜라닌 반응을 진행하기 위해서는 proPO가 편도 세포로부터 빠져나와야 한다. 여기서 PG의 중개반응이 일어난 다(Shrestha and Kim, 2008). 즉, 편도세포의 세포붕괴(oenocytoid cell lysis)를 통해 proPO가 편도세포 내부에서 혈장으로 방출하게 된다. 이때 PRR의 병원체 인식신호를 통해 미리 활성 화된 단백질분해효소의 일종인 PAP (proPO-activating protease) 이 proPO를 PO로 활성화하여 멜라닌반응을 촉매하게 한다. PG가 편도혈구에 작용하여 proPO을 방출한다는 사실은 이 편 도혈구에 특이적 PGE2 수용체를 발견하면서 뒷받침하게 되었 다(Shrestha et al., 2011). 이 PGE2 수용체는 세포 내 Ca2+ 신호 를 유발하여 궁극적으로 Na+-K+-Cl- cotransporter (NKCC)를 활성화하여 세포 내 이온농도를 높여 형성된 삼투압 차이로 물 이 편도혈구로 들어오면서 세포가 붕괴되는 것으로 설명하였 다(Shrestha et al., 2015). 그러나 아직 PGE2 수용체에서 NKCC 활성까지의 세포내 신호전달과정은 알려지지 않고 있다.

    PG의 체액성 면역 반응 중개

    아이코사노이드가 항생단백질의 발현을 유도한다는 것이 누에(Bombyx mori)에서 최초로 보고되었다(Morishima et al., 1997). 라이소자임 또는 세크로핀과 같은 항생단백질이 세균 감염에 따라 발현되는 데 PG 또는 다른 아이코사노이드 생합 성 억제자를 처리하면 이들 항생단백질의 발현이 억제된다. 반 면에 충체(in vivo) 또는 기내배양(in vitro)시킨 지방체에 아라 키도닉산을 처리하여 주면 이들 항생단백질의 발현이 일어나 게 된다. 초파리에서는 이러한 아이코사노이드의 활성이 IMD 면역신호를 조절하는 것으로 밝혀졌다(Yajima et al., 2003). 그 람음성 세균 외부 생체막에 존재하는 lipopolysaccharide는 초 파리의 IMD 면역신호를 활성화하는 데 아이코사노이드 생합 성 억제자들을 처리하게 되면 이 면역신호가 작동하지 않게 된 다. 반면에 아라키도닉산을 단독으로 처리하면 IMD 면역신호 가 일어나지 않아 아이코사노이드와 IMD 면역신호 사이에 상 호 보완적 관계가 있다고 설명하였다.

    Toll/IMD 면역신호와 아이코사노이드 사이의 상호관계가 거짓쌀도둑거저리를 대상으로 분석되었다. 이 곤충은 RNA 간 섭이 원활하게 일어나는 곤충으로 잘 알려지고 있다. 먼저 이 곤충을 대상으로 Toll 면역신호와 IMD 면역신호가 존재하는 것을 추정하고 실험적으로 이들 신호에 반응하는 항생단백질 을 확인하였다(Shrestha and Kim, 2010). 따라서 Toll 또는 IMD 신호에 관련 유전자 발현에 RNA 간섭 처리는 이들 면역 신호 하부단계의 항생단백질 발현을 각각 억제하게 된다. 이러 한 조건 속에 PLA2 효소 활성을 분석하였다. Toll 신호가 활성 화되면 이에 따른 특이적 항생단백질의 발현은 물론이고 PLA2 의 활성을 증가시켰다. 유사하게 IMD 신호 활성화에 따라 특 이적 항생단백질과 PLA2 활성이 증가하였다. 그러나 Toll/IMD 신호를 억제하면 세균 감염에도 불구하고 PLA2 효소활성이 일 어나지 않았다. 따라서 본 실험은 Toll/IMD 면역신호가 아이코 사노이드 면역신호에도 관여하는 것으로 밝혀졌다. 그러나 역 으로 아이코사노이드가 어떻게 Toll 또는 IMD 면역신호에 관 여하는 지는 아직 밝히지 못하고 있다.

    PG를 통한 세포성 및 체액성 면역 교신 중개

    파밤나방이 갖는 두 iPLA2 유전자는 세포성 면역작용에 관 여하는 것으로 알려졌다. 흥미롭게도 이들 유전자의 프로모터 영역에는 Toll/IMD 면역신호를 촉진하는 NFkB/Relish 전사인 자의 결합부위가 존재한다(Sajjadian et al., 2019b). 이는 항생 단백질 유전자 발현을 유기하여 체액성 면역을 유도하는 Toll/ IMD 면역신호가 iPLA2를 통해 세포성 면역반응에도 관여한 다는 것을 제시하였다. Toll 면역신호에서 전달자로 작용하는 MyD88 또는 Pelle 유전자의 RNA 간섭은 Toll 신호를 야기하 는 Lys-type 펩티도글라이칸 또는 곰팡이 감염에 대해서 iPLA2 유전자 발현 유기를 억제하였다(Shafeeq et al., 2018). 반면에 Relish 유전자에 특이적 RNA 간섭 처리하면 IMD 면역신호를 유발하는 그람음성균의 감염에 대해서 iPLA2 유전자 발현 유 기를 억제하였다. 이는 Toll/IMD 면역신호가 iPLA2 및 이에 따 른 PG를 통해 세포성 면역을 중개할 수 있다는 면역신호의 상 호신호교신을 의미하였다.

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    혈구세포의 PG 신호전달과정

    편도혈구에서 찾은 PGE2 수용체는 포유동물의 수용체 즉 EP2와 염기서열에서 차이를 보였다. 한편 담배박각시나방 (Manduca sexta)에서 EP2 계열에 속하는 PGE2 수용체가 발견 되었다(Kwon et al., 2020). 이 수용체 유전자는 여러 조직에서 도 발현되었으나, 혈구세포에서는 유독 편도혈구에서만 발현 되었다. 유사한 PGE2 수용체가 파밤나방에서 발견되었다(Kim et al., 2020). 이 수용체가 모든 발육태에서 그리고 조사된 모든 유충 조직에서 발현하였다. 파밤나방에서는 이 유전자 발현의 RNA 간섭은 면역 저하를 유발하여 이 수용체가 면역에 관여하 는 것을 알게 되었다. 또한 Sf9 세포주에 일시발현을 유도하고, 내재된 PGE2 수용체를 short interference RNA (siRNA)로 억 제시킨 가운데 여러 PG 물질의 결합을 조사한 결과 유독 PGE2 에 대해서만 반응성이 높은 것 확인하였다. 이후 CRISPR-Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats- CRISPR associated endonuclease 9)을 이용하여 이 유전자의 결실 돌연변이체를 만들어 면역 및 발육을 조사하였다. 예상대 로 세포성 면역의 일종인 소낭형성을 조사한 결과 돌연변이체 에서 현격하게 낮아지는 면역저하현상을 관찰하였다. 또한 PGE2 수용체는 발육에도 관여하여 생존한 개체들이 왜소한 번 데기 모습을 지녔다. 가장 눈에 띠게 나타나는 표현형 차이는 이 돌연변이체의 암컷 성충은 난모세포의 발달이 없어 불임화 되는 것을 확인하였다. 이상의 결과는 PGE2가 면역은 물론이 고 유충 발육 및 성충 생식에까지 영향을 주는 것으로 CRISPRCas9 돌연변이체를 통해 밝혀졌다.

    면역관련 유전자와 PG 상호작용

    Repat (Response to pathogen) 유전자군이 파밤나방을 중심 으로 밝혀졌다(Herrero et al., 2007). 현재까지 46개의 유전자 가 이 유전자군에 포함된다. 이들 유전자는 다양한 병원체에 대 해서 발현이 유기되는 것으로 알려졌다. 그러나 정확한 면역 중 개 기능은 밝혀지지 않았다. 이 가운데 Repat33에 대해서 아이 코사노이드와 생리적 연관성이 분석되었다(Hrithik et al., 2021). 소형단백질(110개 아미노산)로 Repat33는 아이코사노이드에 의해 발현이 조절된다. Repat33의 발현을 억제하면 세포성 및 체액성 면역반응이 억제된다. 이 단백질의 기능 영역을 분석하 면 signal peptide에 이어 전사촉진 부위가 존재한다. 이는 이 단 백질이 아이코사노이드에 의해 발현되어 체외로 배출된 후 여 러 대상 세포의 면역관련 전사인자에 영향을 주어 면역을 유도 하는 것으로 추정된다. Repat33에 의해 조절 또는 발현되는 면 역 유전자들을 밝히면 아이코사노이드 면역신호의 하위단계를 체계적으로 밝힐 수 있을 것으로 예상된다.

    PG와 소화관 면역

    앞에서 기술한 소화관 면역 과정에서 보듯 병원균 감염에 따 라 Duox 활성을 증가시켜 ROS를 분비하는 현상이 파밤나방 소화관에서도 일어난다(Sajjadian and Kim, 2020). 이러한 소 화관 면역은 아이코사노이드에 반응하여 Duox의 발현 증가와 이와 더불어 소화관 내부에 ROS 증가로 이어졌다. 아이코사노 이드 가운데 PGE2가 단독으로 이러한 Duox 발현 증가를 유도 하였다. 즉, PGE2가 중장의 수용체를 통해 cAMP 이차신호전 달 경로를 활성화하고 이를 통해 Duox 유전자의 발현 증가로 이어졌다. 후속 연구는 PGE2가 Ca2+ 신호를 통해 Duox의 효소 활성을 증가하는 또 다른 신호전달과정을 찾아내고 있다.

    말라리아 원생동물은 학질모기류의 중장세포를 지나 침샘 으로 이동하여 흡혈과정 동안 다음 기주에 전파된다. 따라서 이 들 원생동물과 모기의 중장과는 병원체와 기주의 관계가 일어 나게 된다. 즉, 말라리아 원생동물 감염에 대응하여 기주인 학 질모기류(Anopheles gambiae)는 중장세포에서 면역신호인 PGE2를 분비하고 이에 따라 혈구세포가 소화관 주변으로 모이 게 한다(Barletta et al., 2019). PGE2는 다시 면역기억(immune priming)을 주기 위해 류코트리엔의 일종인 lipoxin A4를 생성 하고 이를 수송하는 Evokin (척추동물의 리포칼린) 단백질에 함유되어 혈구분화인자(hemocyte-differentiating factor: HDF) 로 역할하게 된다. HDF는 과립혈구의 수를 증가시켜주는 기능 을 담당한다. 또한 혈장으로 분비된 PGE2는 편도혈구를 붕괴 시켜 PO를 활성화시키고 멜라닌반응을 증가시켜 중장을 뚫고 혈장으로 침입하는 oocyst 발육태의 말라리아 원생동물을 치 사시키게 된다(Kwon et al., 2021).

    PG 교란을 통한 해충 방제 전략

    아이코사노이드 생합성을 억제하는 곤충병원세균

    곤충병원선충의 장내에 공생하는 XenorhabdusPhotorhabdus 속에 속한 세균이 곤충의 면역억제를 유발하여 기주 선 충의 생존과 성장을 도모한다. 이들 장내세균은 각각 Stei nernemaHeterorhabditis 속에 속한 선충에 공생세균으로 선 충의 감염태 유충이 곤충의 개구부(입, 항문 또는 기문)를 통해 곤충이 혈강으로 침입하게 되면 선충의 장내에 곤충이 혈강으 로 배출된다(Fig. 5). 곤충 혈강에서 이들 세균은 곤충의 면역반 응 공격으로부터 자신과 기주 선충을 보호하기 위해 다양한 방 법으로 면역억제 상태를 유도한다. 이 가운데 가장 잘 알려진 면역억제 기작이 아이코사노이드 생합성 효소인 PLA2 효소 활 성 억제이다. 이 효소를 억제하기 위해 이들 세균은 다양한 이 차대사산물을 생성하여 곤충 혈강으로 배출하게 된다.

    곤충병원선충과 공생세균은 종 특이적으로 연계되어 있다 (Table 2). 기본적으로 1:1의 관계로 특정 종의 선충은 특정 종 의 세균을 지니게 되는 데, X. bovienii와 같이 일부 세균 종은 여 러 기주 선충에 연계되어 있다.

    공생세균이 아이코사노이드 생합성을 억제하여 대상 곤충 에 대한 면역억제를 유발하는 현상은 Park and Kim (2000)X. nematophila 세균을 통해 최초로 밝혔다. Kim et al. (2018b)P. temperata temperata 세균을 주입 후에 생체 내의 혈구세 포들의 움직임을 형광현미경을 통해 관찰하였다(Fig. 6). 비병 원성 세균인 대장균을 주입하면 파밤나방의 혈구가 감염 초기 에 활발한 활착현상을 보이게 된다. 그러나 P. temperata temperata 세균을 주입하면 이러한 혈구활착 현상이 저조하게 나타나는데, 이는 이 시기에 대장균 감염체에서는 PLA2의 활 성이 높은 반면에 병원세균을 주입한 경우에는 PLA2 효소활성 증가가 나타나지 않았기 때문이다.

    세균이 분비하는 PLA2 억제자를 탐색하기 위해 먼저 X. nematophila의 세균 배양액을 유기용매로 추출한 결과 에틸아 세테이트 분획구에서 PLA2 활성을 억제하는 능력이 높았다. 이후 이 유기용매 추출액을 다단계로 분획하여 benzylideneacetone (BZA)과 더불어 유사한 화학 구조를 갖는 cPY (cyclic proline-tyrosine) 및 Ac-FGV (acetylated phenylalanineglycine- valine)의 두 가지 펩타이드 유사체가 화학 동정되었다 (Ji et al., 2004). 이러한 방식의 물질추출 및 동정 전략은 다양 한 유기용매 추출 방법 및 상이한 세균 종인 Photorhabdus temperata temperata을 대상으로 새로운 PLA2 억제제가 추가 로 화학 동정되었다(Seo et al., 2012).

    한편 X. hominickii라는 세균이 국내에서 채집된 Steinernema monticolum에서 분리되었다(Park et al., 2017). 이 세균의 전장 서열은 Next Generation Sequencing 기술 가운데 하나인 PacBio RS II (PACBIO, Inc., Menlo Park, CA, USA) 염기서열 분석기 를 이용하여 판독되었다. 약 400 Mb의 전장 서열은 60x로 판독 되었으며 이 전장 서열은 GenBank에 PRJNA324515의 접근번 호로 등록되었다. 전체 332개 유전자 및 4개의 플라스미드 (Xh-P1 (104,132 bp), Xh-P2 (95,975 bp), Xh-P3 (88,536 bp) 및 Xh-P4 (11,403 bp))가 존재한다는 것을 알게 되었다. 이들 플라스미드가 가지고 있는 유전자 가운데 multidrug export ATP-binding/permease 유전자가 이 세균이 갖는 항생제 내성 에 대한 후보 유전자로 지목 받았다. Sadekuzzaman et al. (2017b)은 이 세균이 높은 살충력을 지녀 불과 622마리로 파밤 나방 5령충에 대한 반수치사약량을 갖는다고 발표하였다. 이 논문에서 이 세균이 PLA2를 억제하여 세포성 면역인 소낭형성 과 체액성 면역인 항생단백질의 발현을 억제한다고 보고하였 다. 아울러 이 세균도 이차대사산물 가운데 기존에 보고된 oxindole을 포함한다고 밝혔다. 이 세균의 높은 살충력과 면역 억제 능력을 밝히기 위해 Mollah et al. (2020)은 전체 이차대사 산물을 부탄올로 분리하고 PLA2 억제물질을 추적하여 3- ethoxy-4-methoxyphenol (EMP)을 비롯하여 새로운 억제자들 을 밝히게 되었다(Fig. 7). 다양한 이차대사산물이 이들 세균에 서 생산된다는 점을 바탕으로 Mollah and Kim (2020)은 14종 의 공생세균을 확보하고 이들에서 생산되는 이차대사산물을 모두 GC-MS로 추정하였다. 전체 182 종류의 화합물이 동정되 었고, 이들 화합물의 종류와 이를 생산하는 세균의 병원력 차등 성 사이에 상관관계를 분석하여 이 가운데 독성이 높은 화합물 을 분석하였다. 흥미롭게도 병원성이 높은 균주에서 특이적으 로 합성되는 이차대사산물은 PLA2 활성 억제 효과가 높아 이 들 세균의 병원성과 아이코사노이드 생합성 억제는 높은 상관 성을 지닌다는 것을 확인하였다. 다양한 화합물 가운데 BZA와 EMP의 면역억제 능력이 높다는 데 일치하여 이들 물질을 이용 한 해충 방제 응용에 기대를 모으고 있다.

    종합생물방제(Integrated Biological Control)

    환경친화형 해충 방제에 필수적 방제 수단이 생물농약이다. 그러나 지효성 및 환경 조건에 따른 약효의 불안정성으로 많은 작물 재배에 화학 농약에 대한 의존도 여전히 높다. 이러한 한 계를 극복하고자 상호 협력적 살충 작용점 또는 기작을 갖는 생 물농약끼리 혼합하여 약효를 극대화하자는 개념이 종합생물방 제이다. 다양한 미생물 살충제는 대상 해충의 전염병을 유발하 여 방제를 꾀하고 있다. 여기에 대상 곤충의 면역저하를 유발시 키는 미생물 또는 배양액을 추가하여 주면 병원미생물에 대한 곤충의 면역 방어를 무력화하여 병원성을 극대화할 수 있다. 이 를 배경으로 다음 두 가지의 종합생물방제를 소개한다.

    Bacillus thuringiensis (비티)와 종합생물방제

    비티 살충제는 인축에 대한 영향이 거의 없이 대상 곤충만 효과적으로 치사하게 하는 이상적 생물농약이다. 최근에는 이 세균의 독소단백질만 이용하기 위해 이 독소단백질 유전자를 식물체에서 발현시키는 형질전환작물이 담배, 목화, 콩 및 옥수 수에 이르기까지 확대되고 이를 재배하는 면적이 기하급수적 으로 증가하고 있다(Tabashnik et al., 2013). 그러나 다른 화학 농약과 마찬가지로 비티 농약에 대해서 해충의 저항성이 실내 집단은 물론이고 야외 농작물 재배지에서 보고되고 있다.

    비티에 대한 해충의 저항성 기작을 살펴보면서 비티 저항성 관리는 물론이고 비티의 살충력을 높이는 ‘비티플러스’의 개발 이 가능하게 된다. 비티 약제에 대한 해충의 저항성 기작은 앞 에서 기술한 비티의 병원성 발현 과정 가운데 어느 한 단계라도 변경이 이뤄지면 저항성으로 연결될 수 있다. 첫째로 비티 독소 단백질의 활성화 단계에서 저항성이 유발될 수 있다. 과도한 단 백질 분해 효소에 의해 독소단백질의 지나친 분해는 비티 살충 제의 효과를 떨어뜨리게 된다(Shao et al., 1998). 또한 활성화 된 독소단백질은 위식막(peritrophic matrix)을 통과하여 위식 막외강(ectoperitrophic space)으로 빠져나가야 하나 독소단백 질이 위식막에 결합하여 이 막을 통과하지 못하면 비티 효과를 떨어뜨리는 효과를 초래한다. 또한 소화관 내 멜라닌 반응에 의 해 독소단백질의 응집 및 응고 과정은 직접적으로 독소단백질 의 활성을 막는 결과를 초래한다(Ma et al., 2005). 둘째로 활성 화된 Cry 독소단백질이 중장세포막에 존재하는 수용체인 캐드 헤린 및 aminopeptidase N의 결합력 변화이다(van Rie et al., 1990;Ferré et al., 1991). 이러한 작용점 변환이 비티 저항성 기 작 가운데 가장 효과적인 비티 저항성 요인으로 여겨지고 있다. 셋째로 손상된 중장세포의 재생세포에 의한 중장의 회복 능력 이다(Loeb et al., 2001). 줄기세포로 여겨지는 재생세포가 손상 된 중장세포의 신호에 따라 세포분열 활성을 증가시켜 생존력 을 높이는 일환으로 해석된다. 끝으로 곤충이 세균 침입에 대한 면역 반응이다. 중장벽이 무너지면서 혈강으로 침입하는 장내 세균에 대해서 곤충이 보이는 면역 방어 활성이 높아지면 비티 에 대한 내성을 높이는 일환이다(Rahman et al., 2004).

    비티 살충제에 대한 곤충의 방어기작을 극복하고자 Xenorhabdus 또는 Photorhabdus 세균 배양액을 혼합하여 새로운 종 합생물방제를 고안하였고, 이를 ‘비티플러스’로 명명하였다. 이 혼합 미생물제의 기본 개념은 곤충의 방어 능력인 면역 과정 을 낮추어 줌에 따라 비티의 살충활성을 증가시켜 주려는 목적 으로 개발되었다. 이러한 개념에서 최초로 시도된 종합생물방 제 농약 개발은 비티와 X. nematophila (Xn)을 혼합하여 시도 되었다(Jung and Kim, 2006a). 파밤나방을 대상으로 시험되었 으며, 이때 3령의 경우는 비티 단독 처리에 100% 살충효과를 보이나, 5령에 이르면서 살충력은 60%을 넘지 못했다. 물론 Xn 은 경구로 처리할 경우 단독으로는 10%를 넘지 못했다. 두 세 균을 혼합한 결과 비티의 살충효과는 현격하게 증가했다. 단독 비티의 경우 반수치사약량은 3,571 μg/mL이나, Xn과 혼합 처 리하면 590.1 μg/mL로 약 83%의 약량 감소를 나타냈다. 더욱 이 치사 속도는 비티 단독은 6일 이상이 소요되는 반면, Xn과 혼용하는 경우는 2.52일로 두 배 이상 빠르게 살충효과가 진행 되었다. 이러한 두 세균의 상승효과는 비티의 작용점이 중장이 고, Xn의 작용점은 혈강이라는 상이한 작용기작에서 비롯된 것 으로 여겨진다. 이를 증명하기 위해 두 세균을 혼합 처리한 후 경 시적으로 파밤나방에서 혈림프를 추출하여 혈강으로의 세균 침 입을 분석하였다. Xn 단독으로 경구 처리한 결과 이 세균 단독 으로는 곤충의 혈강 침입 능력이 없다는 것을 확인하였다. 그러 나 비티와 Xn을 혼합하여 경구 처리하면 48시간이 소요되면서 혈강으로 Xn 세균이 검출되었다. 즉, 비티 세균이 중장벽을 허 물면서 Xn 세균이 혈강으로 침입한 것으로 해석된다. 이 시간은 바로 파밤나방의 반수치사시간과 일치하여 궁극적으로 비티의 살충력을 현격하게 높여준 것이 Xn이라는 것을 반증하게 되었 다. 기타 공생세균에서도 유사한 협력 효과를 나타냈다(Jung and Kim, 2006b). 또한 Xn은 비티에 대해서 저항성이 높은 배추 좀나방에 대해서도 살충력을 현격하게 높이는 효과를 주어 비 티 저항성 관리에 Xn을 이용한 종합생물방제 전략을 고려할 수 있다. Xn의 또 다른 응용은 비티뿐만 아니라 벡큘로바이러스에 도 적용될 수 있다(Jung et al., 2006). 유사한 작용 기작으로 구 강을 통해 중장벽을 감염시키는 벡큘로바이러스는 Xn에게 혈 강으로 들어가게 하는 통로를 제공하여 주게 된다. 벡큘로바이 러스 단독으로는 9일 이상 소요되는 반수치사시간이 Xn과 혼합 한 결과 4.54일로 치사 시간을 현격하게 단축시켰다.

    그러나 야외 조건에서 비티와 Xn을 혼합하여 처리할 경우 비티의 경우는 비교적 높은 야외 안정성을 갖으나, Xn은 대장 균과 마찬가지로 장내 세균으로 쉽게 치사하게 된다. 이에 비티 와 Xn 배양액과의 혼합 처리를 고려하였다. 이러한 이유는 Xn 이 혈강에 침입하여 비티 협력효과를 내는 것은 바로 PLA2를 억제하는 대사물질로 가정하였기 때문이다. 결과는 예상대로 Xn 배양액만으로도 비티의 살충력을 높일 수 있었다(Seo and Kim, 2011). 비티와 Xn 세균을 포함한 배양액 전체를 혼합한 것이나 비티와 Xn 세균을 제거한(0.2 μm 투과 크기 막을 이용 한 세균제거법) 배양액을 혼합한 것 사이에 차이가 없이 경구 처리하는 경우 비티의 살충력을 현저히 증가시켰다. 이는 비티 가 다시 대상 곤충의 중장세포를 허물어 소화관과 혈강 사이를 열어주면, 이때 Xn 배양액에 존재하는 PLA2 억제물질이 혈강 으로 들어가 면역억제를 유발하고, 이때 소화관에 존재하는 비 티 세균은 물론이고 다양한 장내세균이 곤충의 패혈증을 유발 하여 치사를 일으키는 것으로 해석된다.

    비티플러스를 산업화하는 데 선결과제 중 하나가 제형화이 고 단가를 낮추는 문제가 대두된다. 초기에 개발된 비티플러스 는 수화제 형태였다. 비교적 미생물제제를 상온에서 보관하기 편한 제형이었다. 약효가 좋아 농가의 반응이 좋았지만 농민 입 장에서는 수화제 보다는 액상 제형이 사용하는 데 선호하는 제 형이었다. 또한 생산 단가에 있어서도 수화제에 비해 액상 제형 이 훨씬 저렴하였다. 이는 수화제로 제형화하는 데 사용되는 막 투과 및 동결건조 비용을 줄일 수 있기 때문이다. 이를 해결하 기 위해 액상 제형을 개발하였으며, 이 때 고려되어야 할 부분 이 상온 저장 안정제이고 또 두 미생물제의 혼합비율이었다. 상 온 저장 안정제로는 에탄올 10%를 이용하였다. 예상대로 상온 보관이 약 6개월 이상 유지되는 것으로 나타났다. 두 미생물제 의 이상적 혼합비율은 비티의 포자 밀도를 고려하였고, Xn은 48시간 배양액을 이용하였다. 결론적으로 얻어진 비티플러스 액상 제형(1,000 배 희석 제품 기준)은 비티:Xn 배양액:에탄올 = 5:4:1 (v/v)로 결정되었다. 여기서 유효한 비티플러스 제형은 비티의 포자 농도가 106 포자/mL이고, Xn 배양액 유효성분 가 운데 옥스인돌을 표준물질로 10 ppm 이상이 포함된 것으로 결 정하였다. 또한 두 세균(비티, Xn)을 증식시키는 데 연구실에서 는 고가의 연구용 배지를 이용했다. 생산 단가를 낮추는 일환으 로 일반적 공업용 세균 배지를 이용하여 두 세균의 배양을 시도 한 결과 살충력 및 Xn 대사물질의 농도에 있어 차이를 보이지 않았다(Seo et al., 2010). 이러한 세균 배지의 대체는 생산 단가 를 90% 이상 줄이는 효과를 나타냈다.

    살충 효능에 있어서 실내 및 야외 조건에서 탁월한 효과를 보이는 비티플러스의 친환경농자재로서 등록하기 위해서는 환 경 및 인축 독성에 관한 연구가 필요하였다. 우선 환경에 대한 영향 평가로서 천적에 대한 비티플러스의 피해가 분석되었다 (Seo et al., 2011). 천적에 대한 영향 평가는 비티플러스가 포함 하고 있는 유효물질에 대해서 분석되었다. 대상 천적으로는 포 식성 천적 4종, 포식기생성 천적 2종이 검정되었다. 이들 천적 류에 대해서 비록 공생세균이 분비하는 PLA2 억제물질에 대한 독성을 보였으나, 생물제제로 개발한 비티플러스 제품에 대해 서는 천적에 대한 독성을 나타내지 않았다. 수생생물에 대한 영 향 평가로서 잉어에 대한 노출 시험이 진행되었으며, 인축 독성 분석으로서 쥐에 경구로 처리할 경우 Xn 세균은 물론이고 제품 에서도 피해가 없는 것으로 나타났으며, 이는 처리 후 장기 적 출 실험에서 무영향으로 판명되었다. 비티플러스는 이러한 약 효, 약해 및 환경/인축 독성 자료와 제품의 이화학적 자료를 구 비하여 수화제 및 액상 제형에 대해서 각각 친환경농자재 등록 을 받아 산업화되었다. 이러한 종합생물방제는 비록 국내에서 고안된 방제 전략이지만 최근 외국의 여러 연구자들에 의해 검 토되고 있다. 예를 들어, 벗초파리(Drosophila suzukii) 방제에 비티와 Xn 세균의 혼합 처리가 높은 방제효과를 나타냈다고 보 고하였다(Mastore et al., 2021). 한편 Photorhabdus 세균과 비 티의 혼합으로 여러 나비목 해충에 대한 종합생물방제 가능성 이 다양한 외국 연구실에서 검토되었다(Benfarhat-Touzri et al., 2014;Jallouli et al., 2018). 이러한 국제적 추세 속에 국내에 서는 종합생물방제의 적용 범위를 높이려는 또 다른 차원의 연 구가 진행되었다. 이러한 배경에는 복합 비티 독소단백질을 통 한 대상 해충의 범위도 넓히려는 전략으로 다양한 비티와 Xn를 혼합한 이중비티플러스(Dual Bt-Plus)도 소개되었다(Eom et al., 2014).

    곤충병원성곰팡이와 종합생물방제

    곤충병원성곰팡이는 전 세계적으로 최소한 90속, 700 여종 에 이르고 있다(Goettel et al., 2005). 이들은 크게 4개의 분류군 으로 나뉠 수 있어 Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes 그리고 Ascomycetes가 포함된다. Oomycetes는 균사체에 키틴 없이 셀룰로오즈를 포함하고 두 개의 편모를 지닌 유주자를 갖 는 것이 특징으로 대표적 곤충병원성곰팡이로 모기류에 기생 하는 Lagenidium giganteum이 이 분류군에 속하게 된다. Chytridiometes는 세포벽 성분이 키틴으로 셀룰로오즈는 포함 하고 있지 않다. 또한 유주자가 후방에 단일 편모를 지니고 있 다. 약 70종 이상의 곤충병원성곰팡이가 이 분류군에 속한다. Zygomycete는 격막이 없는 다핵질의 균사를 갖는 것이 특징이 며 배우자낭(gametangia) 사이에 교미를 통해 접합포자(zygospore) 를 형성한다. Ascomycetes는 격막이 존재하며 반수체인 균사를 지닌다. 자실체(fruiting body)의 자낭(ascus)에서 8개 의 성분화 포자인 자생포자(ascospore)를 형성한다. 유주자는 운동성이 없다. 다양한 곤충병원성곰팡이가 이 분류군에 속하 며 대표적으로 동충하초로 알려지고 있는 Cordyceps 속으로 약 300종 이상이 이 속에 포함된다고 알려지고 있다. 또한 유성 세대를 형성하는 능력을 상실한 Ascomycetes에 속한 다양한 변이체들이 Hypomecetes의 독립적 분류군을 형성하여 여기에 40속 이상이 포함되고 있으며 이들은 중요한 곤충병원성곰팡 이류를 포함하고 있다. 즉, Aspergillus, Beauveria, Culicinomyces, Gibellula, Hirsutella, Hymenostillbe, Lecanicillium, Metarhizium, Nomuraea, Paecilomyces, Sorosporella, Tolypocladium 등이 이 분류군에 포함된다.

    곤충병원성곰팡이가 대상 곤충에 기생하여 치사시키는 일 반적 생활사는 감염 포자의 곤충 체벽 부착으로 비롯된다. 곤충 의 큐티클의 부착을 높여주기 위해 포자는 점착물질을 함유할 수 있다(Hajek and St. Leger, 1994). 이 단계에서 다양한 환경 적 요인(예, 습도, 온도 등)이 포자접종율에 관여하게 된다. 예 를 들어, Hypomecetes는 20-30℃의 온도가 유지되어야 하지 만, Entomophthorales는 15-25℃의 감염 온도를 선호한다. 이 후 키틴 및 단백질 분해를 통해 발아관(germ tube) 성장이 이뤄 지고 체벽을 뚫고 혈강에 이르게 된다. 이후 균사성장과 더불어 기주체를 치사에 이르게 된다. 곤충의 치사에 이르게 하는 원인 은 곰팡이증식에 따른 기주체의 영양소 결핍 또는 곰팡이가 분 비하는 독소에 의해 이뤄질 수 있다. 또한 분생자를 생성하기 위한 분생자병(conidiophore)이 발달되고 분생포자를 생산하 게 된다. 이렇게 형성된 포자는 다시 주변의 기주를 찾아가게 된다. 일련의 병원성 발현 과정에서 곤충병원선곰팡이는 관련 유전자를 순차적으로 발현하게 된다(Shin et al., 2020).

    곤충병원성곰팡이가 생산하는 독소는 효능에서 살충성 및 살균성으로 나뉠 수 있다. 살충성 독소로서 대표적인 것이 Metarhizium spp.가 생산하는 destruxin류이다(Kodaira, 1961). 이들은 cyclodepsipeptide류로서 기본 골격은 5개의 아미노산 과 α-hydroxyl acid이나 다양한 이성체 또는 동족체(congener) 가 포함된다(Vey et al., 2001). Destruxin은 다양한 곤충 종에 대해서 독성을 보이고, 이를 생산하는 곰팡이류의 기주 범위가 비교적 넓어 기주 선택성에 관여하는 것으로 여겨지고 있다 (Amiri-Besheli et al., 2000). Beauveria가 생산하는 독소는 beauvericin으로 다양한 무척추동물에 독성을 보이는 depsipeptide 대사물이다(Hamill et al., 1969;Roberts and Hajek, 1992). 이외에 B. bassiana는 beauverlides, isarolides, bassianolides의 cyclotettradepsipeptide류를 생산한다(Frappier et al., 1975;Suzuki et al., 1977). 비펩타이드류 독소로서 bassianin과 tenellin 이 동정되었으며 이들은 적혈구 세포막의 ATPase를 억제하는 것으로 보고되었다(Jeffs and Khachatourians, 1997). Efrapeptin 류는 Tolypocladium 종이 생산하는 독소로서 살충 및 살비효과 를 나타내고 있다(Matha et al., 1988;Krasnoff et al., 1991). Hirsutellin A는 Hirsutella thompsonii가 생산하는 독소로서 비단 백질성으로 다양한 곤충 및 응애류에 치사효과를 나타내고 있 다(Mazet and Vey, 1995;Omoto and McCoy, 1998). 곤충병원 성곰팡이가 생산하는 살균물질로서 적색의 dibenzoquinone인 oosporein이 Beauveria에서 보고되었고, 세균과 바이러스에 항생능력을 나타냈다(Terry et al., 1992). 기타 beauvericin은 세균에 대해서(Ovchinnikov et al., 1971), destruxin E는 바이 러스에 대해서(Quiot et al., 1980) 항생능력을 보여주었다. 곰 팡이류에 대해서도 항생능력을 보이는 항생물질로서 phomalactone이 H. thompsonii var. synnematos에서 보고되었다(Krasnoff and Gupta, 1994). 따라서 곤충병원성곰팡이는 이러한 병 원성 물질로 곤충 체내에 병원성을 발휘하게 된다.

    곤충병원성곰팡이의 이러한 감염력에 대해서 곤충은 세포 성 및 체액성 면역반응으로 대처하게 된다. 따라서 비티플러스 의 종합생물방제 개념과 유사하게 곤충 면역을 억제하면 이들 곤충병원성곰팡이의 병원성을 높여줄 수 있다는 것이 기본적 방제 전략이다. 백강균(Beauveria bassiana: Bb)의 농도별 처 리에 따라 파밤나방에 대한 병원력이 BZA를 추가하면서 현격 하게 증가되었다(Park and Kim, 2011). 이러한 이유는 Bb 처리 에 따라 파밤나방이 보이는 세포성 및 체액성 면역반응을 BZA 이 아이코사노이드 생합성을 억제하면서 막아주는 면역저하 효과를 실험적으로 증명하였다. Park and Kim (2012)은 후속 연구에서 이러한 Bb에 대한 파밤나방의 면역반응은 Toll 면역 신호에 의해 유기되었고 이 신호가 PLA2를 활성화하였다. 여 기서 Toll 신호가 PLA2를 활성화하는 과정은 Toll 면역신호 가 운데 이 수용체에 사이토카인의 일종인 Spätzle이 부착한 후 MyD88 및 Pelle의 중개자가 존재하여 궁극적으로 NFkB를 활 성화하게 되는 데, 이때 Pelle이라는 인산화효소가 Bb 인식신 호에 반응하여 PLA2의 활성을 촉진하여준 것으로 판명되었다 (Shafeeq et al., 2018). 그러나 여기서 Pelle에 의해 활성화된 기 작, 즉 인산화에 따른 PLA2의 효소 활성 조절에 관해서는 아직 밝혀지지 않다. 노린재목의 해충인 톱다리개미허리노린재 (Riptotus pedestris)에서도 Bb의 감염에 따라 Toll 면역 신호 관 련 유전체의 발현을 밝혔다(Lee et al., 2019). Toll 면역신호가 아이코사노이드 신호와 교신을 통해 곤충 면역력을 극대화하 기에 Xenorhabdus 또는 Photorhabdus 세균의 대사체에 의한 아이코사노이드 생합성 억제는 곤충병원성곰팡이에 대한 방어 기작을 줄일 수 있을 것으로 추정된다. 이러한 시나리오를 바탕 으로 이들 세균 배양액과 곤충병원성곰팡이의 혼합 미생물제 의 종합생물방제제의 개발이 기대된다.

    결론 및 제언

    다가불포화지방산의 생리적 중개 기능은 원생생물(Protist) 로부터 비롯되어 동식물 모두를 망라한다. 특별히 탄소수 18개 의 리놀레익산을 기준으로 식물은 오히려 탄소수를 12개로 줄 여서 자스모닉산(jasmonic acid)으로 식물의 면역 및 다양한 생 리를 조절하는 반면, 동물은 오히려 탄소수를 20개로 늘린 아이 코사노이드를 중심으로 면역과 기타 생리를 조절하고 있다. 이 들 두 종류(자스모닉산과 아이코사노이드)의 불포화지방산이 원생생물인 일부 홍조류(red algae)에서 발견되었다(Bouarab et al., 2004). 따라서 프로스타글란딘은 진화적으로 원시생명 체에서 유래하여 고등동물에 이르기까지 생리 조절자로서 역 할을 담당하고 있다. 곤충 면역은 해로운 병원체를 방어하는 반 응이지만, 과도한 면역반응은 오히려 생존에 위협이 된다. 또한 다양한 병원체에 대해서 비교적 특이적 면역반응을 발현시키 기 위해서는 중개물질의 다양성이 필요하다. 여기에 관여하는 면역중개자들이 소형 산화질소에서 아미노산 유도체 그리고 펩타이드까지 다양하다. 이들이 다시 다양한 화학구조를 갖는 아이코사노이드와 상호 신호교신하면서 면역신호의 다양성과 특이성 그리고 신호의 증폭 효과를 가질 수 있다. 프로스타글란 딘의 생리적 기능은 면역뿐만 아니라 생식 및 배설에 이르기까 지 다양하다. 따라서 프로스타글란딘의 생합성과 신호를 교란 하는 물질을 동정하는 것은 새로운 살충제 개발에 유용한 전략 이 될 수 있다.

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    사 사

    저자가 곤충생리학 학문 분야에 첫걸음을 내딛는 데 바르게 지도하여 주신 부경생 교수님께 본 종설 논문 작성을 통해 깊은 감사와 그리움을 전합니다. 이 논문은 안동대학교 기본연구지 원사업에 의하여 지원되었다.

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    Cross-talks of cellular and humoral immune signaling pathways. Upon microbial infection, nonself signal of pattern recognition receptor ('PRR') is propagated by immune mediators such as plasmatocyte-spreading peptide ('PSP'), octopamine ('OA'), 5-hydroxytryptamine ('5-HT'), and nitric oxide ('NO') via eicosanoids. Eicosanoids activate cellular immune responses by activating integrin to stimulate cell-to-cell interactions via tetraspanin. Eicosanoids also influence on Toll/IMD signaling to modulate expression of antimicrobial peptide ('AMP') genes. PRR also activates the upstream signaling components of Toll pathway such as modular serine protease ('MSP'), spätzle activating enzyme ('SAE'), and spätzle processing enzyme ('SAE'). SAE catalyzes inactive components such as serine protease homolog ('SPH') and phenoloxidase ('PO')-activating protease ('PAP'). Toll signaling also activates PLA2 to produce PGE2, which binds to its receptor ('PGR') and turns on Ca2+ signaling. The secondary messenger, Ca2+, activates sodium-potassium-chloride cotransporter ('NKCC') to generate ion concentration gradient between inside and outside of the oenocyte, which is followed by water incurrent via aquaporin ('AQP'), resulting in oenocytoid cell lysis ('OCL') to release proPO.

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    Domain structure of three PLA2 genes of Spodoptera exigua. In sPLA2, 'SP' and 'CAT' represent signal peptide and catalytic site, respectively. In iPLA2, 'ANK' represents ankyrin motif.

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    Biosynthetic pathway of PGs in insects. PLA2 activated by Ca2+ and MAP kinase ('MAPK') is translocated to membrane and catalyzes phospholipid to release linoleic acid ('LA'). LA is then elongated by long chain elongase ('ELO') to form C20 fatty acid and desaturated by desaturase ('DES') to form arachidonic acid ('AA'). AA is oxygenated by cyclooxygenase-like peroxinectin ('Pxt') to form PGH2, which is the substrate to be isomerized to various PGs including PGE2 by PGE2 synthase ('PGES'), PGD2 by PGD2 synthase ('PGDS'), PGI2 by PGI2 synthase ('PGIS'), and TXB2 by TXA2 synthase ('TXAS').

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    Hemocyte-spreading behavior driven by PGE2 in hemocytes of Spodoptera exigua. Diagram demonstrates actin cytoskeleton rearrangement by F-actin growth and volume change by aquaporin (AQP) activation. Photo shows spread hemocytes in which F-actin is labeled by FITC (green) and nucleus is stained with DAPI (blue).

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    Symbiotic life cycle of nematode and bacteria. Nematodes include Steinernema and Heterorhabditis. Bacteria include Xenorhabdus and Photorhabdus.

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    Immunosuppression of Spodoptera exigua by infection of a pathogenic bacterium, Photorhabdus temperata temperata. Hemocyte-spreading behavior post-infection (PI) is active at infection of a non-pathogenic bacterium, Escherichia coli. Photos show F-actin detected by FITC (green) and nucleus stained with DAPI (blue). Scale bar indicates 10 μm. Figure is modified from Kim et al. (2018b).

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    Secondary metabolites produced by Xenorhabdus nematophia, X. hominickii, and Photorhabdus temperata temperata.

    Different prostaglandins (PGs) detected in insects

    Specific association of entomopathogenic nematodes and symbiotic bacteria

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