시설재배지 확대로 휴면 기작을 지니지 않는 해충들이 겨울 기간 최소한 간이 보온 시설을 통해 극한 저온 피해를 극복하면 서 국내 월동을 시도하고 있다(Park et al., 2014). 이러한 시설 재배지 확대와 더불어 기후변화는 해충상의 변화를 유발하였 다(Skendžić et al., 2021). 이 가운데 1993년도에 국내에서 처 음 발견된 이후 급속도로 외래 해충이 번진 사례가 꽃노랑총채 벌레(Frankliniella occidentalis)에서 볼 수 있다(Han et al., 1998). 다양한 기주 범위를 갖으며, 25°C에서 불과 12.1일만에 한 세 대를 진행하는(Katayama, 1997) 빠른 생활사 그리고 -5°C에서 30일을 견디는 내한성(Katayama and Ikeda, 1995) 기반으로 시설재배지에서 월동에 성공한 이 총채벌레는 현재 전국적으 로 분포하고 있다.

꽃노랑총채벌레는 다식성으로 화훼류와 채소류를 대상으로 작물 피해를 주고 있다. 일차피해는 이 곤충의 작물체에 대한 직접적 섭식 작용에 기인한다. 이 곤충의 구기 구조를 살펴보면 1쌍의 큰턱이 융합되어 1개의 구침으로 변형되어 식물 조직을 찔러 세포를 파괴하면서 나오는 즙액을 1쌍의 작은턱으로 구성 된 흡수형 구기통로를 통해 빨아들이는 전형적인 찔러빠는 입 (pierce-sucking mouthpart)을 가지고 있다(Hunter and Ullman, 1989). 이러한 섭식행동 관찰은 전기침투도 분석에서 나타난 P 파형(큰턱 식물체 침입활동), Q 파형(작은턱 식물체 침입활동), R 파형(즙액 흡수) 분석으로 뒷받침되었다(Kindt et al., 2003). 이러한 섭식 행동을 바탕으로 작물체의 상이한 부위를 가해하 여 경제적 손실을 주게 된다. 예를 들어, 잎을 가해하면 엽육조 직이 피해를 받아 잎의 은백화, 뒤틀림 또는 홈 자국을 초래하 며, 과실 부위를 가해하면 기형 또는 피해부위 탈색을 유발하 며, 꽃을 가해하면 조기 낙화 유발 및 종실 충실도가 낮아져 수 량 감소로 이어지게 된다(Reitz et al., 2020). 실제로 국내 국화 재배지에서 꽃노랑총채벌레 피해가 국화잎을 기준으로 35~45% 를 차지한다고 보고하였다(Park et al., 2002). 과채류의 경우 과 실에도 직접 피해를 주었다. 예를 들어, 가지 과실에 섭식 피해 자국을 남겨 상품성을 하락시켰고, 피망의 경우는 과실표면 및 꽃받침에 뚜렷한 식흔을 남겨 상품성 하락과 수량 감소로 이어 졌다(Park et al., 2009).

이차피해로서 꽃노랑총채벌레는 토스포바이러스의 일종인 토마토황화위조바이러스(tomato spotted wilt virus: TSWV)를 전파한다(Rotenberg et al., 2015). 바이러스 전파 기작은 이 곤 충의 섭식 행동 가운데 큰턱의 탐침 과정 동안 일어나는 체외소 화과정 속에 침샘에 존재하는 효소와 더불어 보독충의 경우에 는 TSWV가 식물체로 이동하여 바이러스 전파를 가능하게 하 는 것으로 보고 있다(Stafford et al., 2011). 자연계에서 TSWV 는 총채벌레에 의해서만 전파되며, 여기에 현재까지 9종의 총 채벌레가 알려져 있으며(Rotenberg et al., 2015), 이 가운데 국 내에 분포하는 종은 꽃노랑총채벌레, 대만총채벌레(F. intonsa) 그리고 파총채벌레(Thrips tabaci)가 포함된다. TSWV가 속한 토스포바이러스는 약 1,000 종 이상의 기주 식물에 감염하여 전 세계적으로 막대한 경제적 손실을 주고 있는 데, 미국의 경 우 연간 14억 달러 이상의 경제적 피해를 준 것으로 추산되었다 (Culbreath et al., 2003). 이 바이러스는 3개 조각으로 나뉜 RNA 게놈을 지닌 바이러스로서 여기에 5개의 유전자(open reading frame; ORF)를 암호하고 있다. L 조각에는 RNAdependent RNA polymerase (RdRp) 유전자, M 조각에는 당단 백질(G_C와 G_N) 유전자와 비구조단백질(NS_M) 유전자 그리고 S 조각에는 비구조단백질(NS_S)과 nucleocapsid 단백질(N) 유전 자들을 갖고 있다. 이러한 기본 바이러스 게놈 구조에 지역적 및 기주에 따른 바이러스 변이가 일어나게 되고 여기에 상이한 바이러스 계통들의 동시 감염에 따른 게놈의 재구성 일어날 수 있기에 TSWV 게놈 변이는 더욱 다양해질 수 있다(Webster et al., 2011;Tentchev et al., 2011).

고추(Capsicum annuum)는 국내 가장 넓은 재배면적을 가 지고 있는 조미 채소로 2020년 재배면적은 31,146 ha로 전체 조미채소 재배면적의 35.6%를 차지하고 있으며, 특히 경북 (7,906 ha) 그 가운데 안동지역(1,456 ha)이 주요 산지이다 (KOSIS, 2020). 고추에 발생하는 식물병은 모두 39종이 보고 되고 있으며(KCPA, 2020), 이 가운데 안동을 중심으로 경북 북부지역에 9종의 병이 보고되었는데 바이러스에 의한 발병율 이 가장 높다(Seo et al., 2011). 고추를 가해하는 해충은 진딧 물, 총채벌레, 가루이, 잎응애 및 담배나방 등을 포함하여 모두 35종이 알려져 있으며(RDA, 2020) 진딧물과 총채벌레에 의 한 바이러스병 매개가 심각한 실정이다(Lee et al., 2004). 특히 TSWV를 전파하는 총채벌레류가 고추 열매 끝부분이 검게 변 하면서 표면이 거칠어지고, 이후 고추가 붉어지면 피해 부위가 하얗게 된 뒤 수확 후 건조 이후에도 퇴색된 상태로 남아있어 상품성이 저하되는 일명 칼라병을 유발하고 있다(Moon et al., 2006;Seo et al., 2018). 특히 2000년 이후로 고추 바이러스 발 생율이 현저히 높아져 1999년에 1.0%에서 2000년에 30.5%로 증가한 뒤 2007년과 2008년 조사에서도 각각 32.5%와 36.7% 의 포장 발병률을 보여 지속해서 증가하고 있다(Kim, 2000;Seo et al., 2011).

TSWV에 저항성인 품종들의 재배는 이들 칼라병의 발병을 억제하기 때문에(Kim et al., 2021), 많은 안동 고추 재배 농가 에서는 TSWV 저항성 품종을 사용하고 있다. 그러나 이 지역에 서 매년 고추 재배 농가에서 이 바이러스 발병을 지속적으로 보 고하고 있다. 이에 대한 근본적 원인 규명을 하고자 본 연구는 내병성 품종이 재배되는 안동 농가를 중심으로 발생되는 총채 벌레류를 파악하고 이들의 유전적 변이를 조사하였다. 아울러 TSWV 감염체들을 지역적으로 확보하여 이 바이러스의 유전 적 변이를 조사하였다.

재료 및 방법

꽃노랑총채벌레 실내사육

국립농업과학원(전주)에서 분양받아 증식시켰다. 사육 환경 조건은 온도 25±2°C, 상대습도 65±5%, 14 시간 광주기 조건을 유지하였다. 원형 사육 용기(지름 100 mm, 높이 40 mm)에 알부 터 성충까지 사육하였으며, 5일 동안 발아시킨 강낭콩(Phaseolus coccineus)을 유충과 성충의 먹이로 제공하였다.

총채벌레 야외 모니터링

2021년 3월 10일 경북 안동시 풍산읍 수동리, 풍산읍 매곡 리, 풍천면 하회리에 소재한 시설재배지에 황색 끈끈이트랩 (10×15 cm, 그린아그로텍, 경산, 한국)을 각 비닐하우스(약 300 평 규모)당 3 지점에 설치하고, 매주 수거하고 교체하여 주었다. 총채벌레류의 밀도 조사를 위하여 수거한 트랩을 실험실로 가 져와 해부현미경(M165FC, Leica, Wetzlar, Germany) 하에서 꽃노랑총채벌레를 동정하였다.

꽃노랑총채벌레와 대만총채벌레 형태 동정

Frankliniella 속의 특징인 앞가슴 자모가 4쌍인 것과 홑눈 사이 자모로 구분하였다(Fig. 1). 암수 구분은 몸이 굵고, 복부 끝 마디에 산란관이 있으면 암컷, 가늘고 정소가 보이면 수컷으 로 구분하였다. 꽃노랑총채벌레와 대만총채벌레의 구분은 암 컷의 경우 꽃노랑총채벌레는 몸 색깔이 노란색이거나 복부에 띠를 형성하고 있고 겹눈 뒤 자모가 긴 반면, 대만총채벌레는 갈색이고 띠를 형성하지 않고 겹눈 뒤 자모가 짧은 형질을 이용 하였다. 반면 수컷은 꽃노랑총채벌레는 겹눈 뒤 자모가 길어서 대만총채벌레와 구분을 할 수 있지만, 자모가 떨어지거나 몸의 다른 부위와 겹쳐지는 경우는 촉각 4번째, 5번째 마디의 말단부 ⅓ 영역이 진하게 어두우면 꽃노랑총채벌레이고 반면에 이보 다 가늘게 ¼ 영역이 연하게 어두우면 대만총채벌레로 구분하 였다. 그러나 이상의 형태 형질로 구분이 어려운 경우는 미확인 총채벌레 개체로 구분하였다.

꽃노랑총채벌레 집단유전 분석

안동 3개 지역(풍산, 하회1, 하회2), 충북 괴산 및 실험실 집 단들을 대상으로 cytochrome oxidase I (COI) 서열을 바탕으로 유전거리를 분석하였다. 꽃노랑총채벌레 게놈 DNA 추출은 Chelex resin 100 (Biorad, Hercules, CA, USA)를 이용하였다. 간략히 기술하면, 슬라이드글라스 위에서 각 개체를 10 μL의 Chelex 용액에 커버글라스로 덮고 밀착 분쇄했다. 추가로 40 μ L의 Chelex 용액을 이용하여 충체 추출액을 수거한 후 72°C에 서 1시간 동안 열처리하였다. 이후 14,000 × g에서 3분간 원심 분리한 후 상등액을 PCR 반응의 주형으로 이용하였다. Taq 중 합효소(진올, 서울)의 제조사 방법으로 PCR을 진행하였고 사용 된 프라이머는 5'-ATAGGTCTGTTCGACCTTTA-3'와 5'-GG AATTATCTTTTCCCGTCA-3'였다. PCR 온도 조건은 열처 리(98°C, 1분) 이후 35회 증폭 주기를 변성(98°C, 10초), 프라이 머결합(55°C, 15초), 사슬연장(68°C, 2분)를 이용하였다. PCR 산물 은 pCR2.1-TOPO (Invitrogen)를 이용하여 대장균(Escherichia coli TOP10에 형질 전환했다. 재조합 벡터 추출은 Exprep Plasmid SV mini (진올)를 이용하였다. EcoRI 제한효소(다카 라코리아, 서울)를 이용하여 PCR 산물의 삽입 여부를 확인하 였다. 염기서열 분석은 (주) 마크로젠(서울)에 의뢰하여 양방향 으로 진행하였고, 얻어진 공통염기서열을 NCBI-GenBank에 수록된 염기서열을 대상으로 BlastN 검색엔진으로 유사 서열 을 가진 종 정보를 확인하였다. GenBank에 수록된 꽃노랑총채 벌레 염기서열을 모아 본 연구에서 얻어진 서열과 함께 MEGA X 프로그램의 Neighbor-Joining (NJ) 분석을 통해 분자계통수 를 얻었다. 이 분자계통수의 가지별 Bootstrap 수치는 1,000회 반복 분석으로 얻었다.

안동지역 고추 비닐 온실에서 총채벌레류의 경시적 밀도

고추재배지에 발생하는 전체 총채벌레류 동정을 위해 3월과 4월 중순까지는 매주 포획된 총채벌레류를 동정하였고, 4월 하 순부터는 2주일에 한 번씩 동정하였다. 5월 5일부터는 풍천읍 하회리의 포장만 밀도를 조사하였다. 트랩에 유인된 총채벌레 류의 밀도가 높아지는 6월 15일부터는 표본의 손상이 비교적 적은 평판 트랩 부위에서 200~300마리를 임의로 선발하여 동 정하였다. 동정한 종은 고추에 피해를 많이 주고 있는 꽃노랑총 채벌레 암컷과 수컷, 대만총채벌레 암컷과 수컷, 다른 총채벌레 종 및 미확인 총채벌레 개체로 나누어 정리하였다.

꽃노랑총채벌레 생식방식 분석

단성생식 유무를 조사하기 위해 번데기 단계서 개체별로 나 눠 사육하였다. 우화한 성충의 암수를 구분하고, 암수 1쌍, 암컷 2마리 그리고 수컷 2마리를 각각 사육 용기에 투입하였다. 각각 의 처리는 10회 반복하였다. 처리 5일 후 부화한 유충의 밀도를 차세대 개체 수로 산출하였다.

고추 칼라병 유관조사

고추 신초의 잎말림 및 성장 잎의 동심원 반점을 기준으로 1 차 이병체를 선발하였다.

TSWV 혈청 진단기술

TSWV 특이적 진단키트(Agdia, Elkhart, IN, USA)를 이용 하여 제조사에서 추천된 방법을 따라 진행하였다. 이 방법을 간 략히 기술하면, 앞에서 기술한 TSWV 감염증상을 보이는 고춧 잎 1개를 SEB1 추출완충용액이 담긴 플라스틱 봉지에 넣고 입 구를 봉한 뒤 잎 부위를 중심으로 봉지 외부에서 문지르며 마쇄 했다. 완충용액이 녹색으로 변하게 되면 플라스틱 봉지를 열고 TSWV 특이적 ImmunoStrip을 추출액에 삽입시켜 10분 후 지 정된 위치에 띠 발색으로 확인하였다. 이때 추출 정도를 확인하 기 위한 대조 띠를 확인한 후 TSWV 항체가 있는 부위에 발색 띠 유무를 바탕으로 이 바이러스 존재에 대한 음성 및 양성을 판정하였다.

TSWV 분자 진단기술

바이러스 RNA가 감염식물과 꽃노랑총채벌레에서 각각 추출 되었다. 감염 식물체의 바이러스 RNA 게놈은 Viral Gene-spin Viral DNA/RNA Extraction Kit (인크론, 성남)를 이용하여 추 출하였다. 간략하게 기술하면, 감염 의심 고춧잎(지름 0.5 cm 원형 시료)을 1.5 mL 튜브 넣고 500 μL의 용해완충용액을 첨 가한 후 멸균된 막대로 마쇄하였다. 이후 10분간 상온에서 반응 후 250 μL 상등액 추출시료를 얻었다. 여기에 결합완충용액을 500 μL를 첨가하고 핵산결합컬럼을 이용하여 추출된 RNA를 모았다. 이를 다시 50 μL의 RNase 제거 물을 이용하여 수거하 였다. 꽃노랑총채벌레에서 바이러스 게놈은 Trizol RNA 추출 키트(Thermo Fisher Scientific Korea, Seoul, Korea)의 제조사 방법을 따랐다. 성충 3마리를 멸균 처리된 슬라이드글라스에 올려놓고, Trizol 용액 10 μL를 첨가후 커버글라스로 눌러 곤충 시료를 마쇄하였다. 마쇄된 곤충 시료는 다시 190 μL의 Trizol 용액으로 수거하였다. 이후 제조사의 방법대로 시료 부피만 조 정하여 RNA를 추출하였다.

추출된 RNA는 바이러스 프라이머 세트(Table S1)를 Su PrimeScript RT-PCR Kit (GeNet Bio, Daejeon, Korea)에 첨가 하여 RT-PCR을 진행하였다. 먼저 역전사는 50°C에서 30분간 진행되었다. 이후 PCR 반응은 초기 열처리(95°C, 2분) 이후 DNA 변성조건(95°C, 30초), 프라이머결합조건(55°C, 30초), 사슬연장조건(72°C, 1분)의 온도순환을 40회 반복하였다. 증 폭된 PCR 산물은 1% 아가로즈 겔에 135 V 전압으로 25분간 전기영동하여 증폭된 DNA를 분리하였다.

TSWV 유전자 서열 분석

TSWV의 4개 유전자(N, NSs, NSm)의 open reading frame (ORF) 서열을 GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)로 부터 AGM53740.1, BAA00540.1, NC_002050.1의 기탁번호를 통해 얻었다. ORF 전체를 얻기 위해 양방향에서 20 mer의 프라이머를 각각 제작 하였다(Table S1). ORF를 얻기 위한 PCR 반응조건은 초기 열 처리(95°C, 2분) 이후 DNA 변성조건(95°C, 30초), 프라이머결 합조건(52°C, 30초), 사슬연장조건(72°C, 1분)의 온도순환을 40회 반복하였다. PCR 증폭물은 PCR2.1 클로닝벡터(Thermo Fisher Scientific Korea)에 삽입하여 대장균 TOP10 균주를 형 질전환하였다. 배양된 형질전환 대장균에서 재조합 벡터를 추 출하여 염기서열 분석에 이용되었다. 염기서열 분석은 M13F 와 M13R의 universal 프라이머를 이용하여 양방향으로 분석되 었다(마크로젠, 서울). 분석된 DNA 서열들은 SeqMag 프로그 램(DNAStar, Madison, WI, USA)을 이용하여 공통서열을 얻 었다.

TSWV 섭식 처리 및 꽃노랑총채벌레 체내 증식 분석

TSWV 감염 고추로부터 바이러스 추출액을 위에서 기술한 바와 같이 얻고 강낭콩을 10분간 침지시켰다. 이후 상온에서 30 분 건조한 후 6시간 절식시킨 총채벌레 유충과 성충에 3시간 섭 식시켰다. 총채벌레 체내 TSWV의 농도를 측정하기 위해 RT-qPCR을 진행했다. 측정당 100마리의 개체를 하나의 시료 로 상기 방법대로 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 iScript Select cDNA Synthesis Kit　(BioRad, Hercules, CA, USA)에 포함된 random primer를 이용하여 프라이머 결합조건(25°C, 5 분), 역전사(42°C, 45분) 및 역전사 효소 불활성(85°C, 5분)을 거쳐서 cDNA를 형성하였다.

바이러스 농도와 qPCR의 Ct 사이에 표준방정식을 얻기 위 해 TSWV의 N 유전자에 특이적 프라이머 세트(5‘-GAGATT CTCAGAATTCCCAGT-3’, 5‘-AGAGCAATCGTGTCAAT TTTATTC-3’)를 이용하여 증폭물을 얻었다. 이 증폭물을 Expin Gel SV (진올, 서울)를 이용하여 DNA 추출하고 Nanodrop spectrophotometer (Theromo Fisher Scientific Korea)을 이용 하여 DNA 정량분석하였다. 상이한 DNA 시료로 희석한 후 Step One Plus Real time PCR system (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)를 이용하여 DNA 양에 따른 상이한 Ct값 을 얻고 이들의 회귀방정식을 얻었다(Table S2). qPCR을 위해 서 SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan)에 의해 qPCR이 진행되었다. 곤충 체내 TSWV 농도는 동일한 RT-qPCR을 통해 Ct 값을 얻고 이를 통해 Table S2에 있는 표준방정식을 통해 산출하였다. 바이러스 농도는 virions per thrips로 표시하였다.

통계처리

처리 효과는 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1989)을 이 용하여 one-way ANOVA 분석을 하였다. 처리 평균간 비교는 LSD 방법을 이용하여 제I형 오류 확률 0.05를 기준으로 판별하 였다.

결 과

안동지역 시설 고추재배지 총채벌레 발생 및 종류

고추 정식(3월 10일) 직후(3월 24일～3월 31일) 트랩에 대 만총채벌레가 포획되었다(Fig. 2, AD2 집단). 조사 이외의 안 동지역에서 3월 31일에 1마리 암컷 꽃노랑총채벌레를 관찰하 였지만, 조사지역에서 꽃노랑총채벌레는 4월 7일부터 포획되 었다. 총채벌레는 5월 18일에 단일 트랩에 최대 평균 61마리까 지 포획되어 첫 발생 최대 피크를 이루었다. 동일한 시기의 첫 발생 피크가 꽃노랑총채벌레에서 나타났다. 두 번째 총채벌레 의 발생 최대 피크는 6월 22일에 시작되어 7월 27일까지 1달 이 상이 나타났다. 동일한 시기에 꽃노랑총채벌레의 두 번째 발생 최대 피크가 있었다. 지역별로 총채벌레의 발생량은 달라 AD1 지역은 전체 총채벌레는 물론이고 꽃노랑총채벌레의 밀도도 낮았다. 반면 AD2와 AD3는 현격히 높은 총 발생 밀도를 보였 으며 아울러 꽃노랑총채벌레의 밀도도 높았다.

조사된 지역의 고추에 발생한 총채벌레의 시기별 발생 상황 을 비교 분석하였다(Fig. 3). 3월에서 7월까지 포획된 총 총채벌 레는 1,702 마리에서 3,054 마리로 조사지역에 따라 큰 차이를 보였다(Fig. 3A). 세 개 지역을 모두 통합하여 분석하여 보면 꽃 노랑총채벌레와 대만총채벌레가 98.6%를 차지하였고, 이 가 운데 대만총채벌레가 58.5%를 차지하여 40.1%를 차지하는 꽃 노랑총채벌레보다 다소 높은 밀도로 포획되었다. 그러나 이러 한 전체적 종별 분포는 조사지역에 따라 차이가 있었다(F = 5.0; df = 2,38; P = 0.0076). 예를 들어, AD1 지역은 대만총채벌 레가 전체의 97.6%이고 꽃노랑총채벌레는 불과 1.7%를 차지 하여 대만총채벌레가 우점종을 보였다. AD2 지역은 대만총채 벌레가 55.5%이고 꽃노랑총채벌레는 41.8%의 상대적 밀도를 보여 두 종이 비교적 균등하게 발생하였다. AD3 지역은 대만총 채벌레가 36.0%이고 꽃노랑총채벌레가 63.4%를 차지하여 꽃 노랑총채벌레가 우점종으로 나타났다.

이들 두 종 및 기타로 구분하여 상대적 발생 밀도를 시기별 로 분석하였다. 고추 정식 이후 초기에 대만총채벌레가 나타났 으며, 4월 이후에는 꽃노랑총채벌레도 발생하였다. 5월 이후에 는 조사지역에 따라 변이를 보이면서 꽃노랑총채벌레가 32～ 45%, 대만총채벌레가 50～66%의 상대 발생빈도를 나타냈다. 월별로 종별 총채벌레 발생 비율은 뚜렷한 차이를 보였다(F = 7.0; df = 4.38; P = 0.0002). 또한, 이러한 시기별 상대 발생빈도 도 조사지역에 따라 달라 Fig. 3B에 보듯 AD3 지역의 경우에는 발생 최성기인 7월에 꽃노랑총채벌레의 발생 비율이 대만총채 벌레의 발생 비율을 초과하였다.

꽃노랑총채벌레 암수 불균형과 단성생식

고추재배지를 중심으로 시기별로 포획되는 꽃노랑총채벌레 와 대만총채벌레의 암컷 비율을 비교한 결과 시기별로 큰 차이 를 나타냈다(Fig. 4A). 전 시기에서 모든 조사지역을 총괄하여 꽃노랑총채벌레는 0.7±0.3, 대만총채벌레는 0.8±0.2의 암컷 비 율을 보여 수컷과 비교하면 암컷으로 편중된 성비를 보였다 (Table S3). 월별로 분석하여 보면 대만총채벌레는 초기에 높 은 암컷 비율이 점차 낮아지는 경향을 보인 반면, 꽃노랑총채벌 레의 경우는 역으로 암컷 비율이 높아지는 경향을 보였다. 이러 한 암수 불균형이 이 곤충의 특이적 단성생식에서 기인하였는 지를 알아보기 위해 꽃노랑총채벌레 성충 암컷 단독 또는 암수 혼합으로 교미시켜 나오는 후세대를 비교하였다. 이때 꽃노랑 총채벌레 암컷만 방치한 경우에도 다음 세대가 생산되었으며 암컷 한 마리당 약 5.5±0.9 개 산란하였으며 모두 수컷을 생산 한 웅성생산(arrhenotokous) 단성생식을 보였다(Fig. 4B). 반면 에 암수를 함께 처리한 결과 생식력이 크게 증가하여 암컷 한 마 리당 약 27.3±4.9 개 산란하였으며 대부분 암컷을 생산하였다.

꽃노랑총채벌레 집단별 유전적 차이

안동지역에서 발생한 꽃노랑총채벌레의 유전적 특징을 파악하 기 위해 COI 서열을 분석하였다(Fig. 5). 안동집단들(‘Pungsan’, ‘Hahoe1’, ‘Hahoe2’)과 대비하여 실내 사육집단(‘Lab’)과 고 추 칼라병이 발생한 괴산 집단(‘Goesan’)을 이용하여 염기 서 열를 비교하였다(Fig. 5A). 분석된 700개 염기서열 가운데 14 개 위치에서 점돌연변이를 나타냈다. 이러한 차이를 계통분류 로 다양한 꽃노랑총채벌레와 비교하였다(Fig. 5B). 전체적으로 꽃노랑총채벌레는 2개의 유전적 계통(‘WFTG’와 ‘WFTL’)으 로 나뉘었다(Rugman-Jones et al. 2010). 대조집단과 안동집단 모두 WFTG 계통으로 분류되었다. 이 가운데 안동 집단 가운데 두 Hahoe 집단은 동일한 서열을 지녔지만, 풍산 집단은 이들 집 단들과 차이를 나타냈다. 괴산 집단과 대조구는 이들 안동지역 집단들과 차이를 나타냈다.

고추 칼라병 발견 및 꽃노랑총채벌레 TSWV 증식 능력

고추 칼라병은 고추 정식 이후 특정 시설재배지(AD3)에서 지속해서 관찰하였다. 발병이 TSWV에 기인하였는지를 알아 보기 위해 병징이 보이는 식물체 부위(Fig. 6A)를 면역진단 키 트로 확인한 결과 양성 반응을 보였다(Fig. 6B). 다시 이 작물체 주위에서 포획한 꽃노랑총채벌레에서 RNA를 추출하여 분자 진단법으로 분석한 결과 전체 5개 시료 가운데 2개체에서 양성 반응을 보였다(Fig. 6C).

꽃노랑총채벌레의 TSWV 접종 및 증식 효과를 분석하기 위 해 실내 꽃노랑총채벌레 집단을 대상으로 안동지역에 칼라병 을 유발한 TSWV 추출물을 강낭콩 먹이를 통해 3시간 섭식 처 리하였다. 유충과 성충에 처리한 결과 모든 발육태에서 이러한 섭식 처리 때문에 총채벌레가 감염되는지를 RT-PCR로 확인 하였다(Fig. 7). 유충의 경우 이 바이러스 섭식 처리는 체내 TSWV 농도를 증가시켰다. 이러한 바이러스 증가는 접종 후 1 일 이내에 일어났다. 성충의 경우 바이러스 감염 이후 체내 증 식이 일어나지 않아 더는 바이러스 농도가 증가하지 않았다.

TSWV 유전적 변이

안동지역(‘Hahoe’, ‘Yongsang’)을 중심으로 검출된 TSWV 와 다른 지역(‘Jeonju’, ‘Goesan’)의 TSWV 사이의 유전적 변 이를 분석하기 위해 이 바이러스가 가지고 있는 5개 유전자 가 운데 3개 유전자의 ORF 아미노산 서열을 비교 분석하였다 (Fig. 8, Fig. S1). TSWV S 게놈 조각에 존재하는 N 유전자 서 열을 비교한 결과 258개의 아미노산 서열 가운데 5개 지점에서 이들 집단 간 차이를 나타냈다(Fig. 8A, Table 1). 이 변이 부위 가운데 전주 집단(‘Jeonju’)은 4개 지점에서 다른 지역 집단과 차이를 나타냈다. 이러한 서열 차이를 계통분류로 분석한 결과 조사한 4개 집단의 N 유전자 서열은 기존에 알려진 TSWV의 상 응 유전자들과 유사성을 보인 반면 TYRV (Tomato yellow ring virus), WSMV (Watermelon silver mottle virus), GBNV (Groundnut bud necrosis virus)의 N 유전자 서열들과는 차이를 나타냈다. 안동 및 괴산 지역집단들의 TSWV는 기존에 국내 고 추재배지에서 발생한 TSWV의 N 유전자(AGM53740.1)와 가 장 높은 유사성을 보였다. 전주 TSWV의 N 유전자도 기존에 국 내에서 보고된 TSWV의 상응 유전자(MN064724.1)와 높은 유 사성을 지녔다. 또 다른 유전자인 NS_S의 경우 전체 467개 아미 노산 서열 가운데 19개 지점에서 집단 간 서열 차이를 보였다 (Fig. 8B, Table 1). 여기에서도 두 안동 집단들은 유사하지만, 전주 및 괴산 집단들과는 차이를 나타냈다. NS_M의 경우 전체 253개 아미노산 서열 가운데 6개 지점에서 변이를 나타냈다 (Fig. 8C, Table 1). 아미노산 서열 계통분류는 이들이 기존에 알려진 TSWV의 상응 유전자와 유사성을 보였고, 다른 바이러 스의 상응 유전자와는 차이를 뚜렷하게 나타냈다.

고 찰

국내 최대 고추 생산지인 안동지역 시설 고추재배지에서 침 입종인 꽃노랑총채벌레와 국내 서식 종으로 알려진 대만총채 벌레가 우점종을 이루고 있다. 총채벌레의 밀도가 높아지는 5 월 이후 이들 두 종이 전체 총채벌레의 95% 이상을 차지하였다. 그러나 이 두 종의 상대적 분포는 특정 시설재배지에 따라 달랐 다. 고추 정식 이후 총채벌레의 발생이 시작되었으나, 초기 발 생 피크는 5월 중순에 낮은 밀도이지만 나타났고, 이후 6월 중 순에서 7월 말까지 이르는 비교적 긴 기간 동안 높은 밀도의 발 생 피크를 이루었다. 이러한 경향은 다른 지역 및 다른 기주 작 물에서도 유사하게 나타났다. 전남지역의 고추와 피망 재배지 에서도 6 ~ 7월에 꽃노랑총채벌레와 대만총채벌레의 큰 발생 피크를 보고하였다(Ko et al., 2013). 전주 지역의 시설재배지 에서도 꽃노랑총채벌레를 대상으로 연간 모니터링한 결과 5월 의 소규모 발생 피크 이후 6 ~ 7월의 높은 발생피크를 나타냈다 (Park et al., 2009). 따라서 본 연구에서 관찰한 발생피크는 기존 에 보고된 총채벌레의 전체적 발생 시기와 크게 다르지 않았다.

두 종의 발생을 비교하여 보면 정식 초기에 대만총채벌레가 먼저 발생하고 이후 꽃노랑총채벌레가 시설재배지로 들어온 것으로 보였다. Ullah and Lim (2015)은 상이한 온도 조건에서 두 종의 증식을 비교한 결과 대만총채벌레가 꽃노랑총채벌레 에 비해 집단의 내재자연증가율(r_m)이 높은 것을 확인하고 해 충성이 상대적으로 높을 것으로 추정하였다. 본 연구 결과는 두 종이 작물체에 가해하는 피해 정도는 알 수 없지만, 대만총채벌 레가 고추재배지 초기 증식 및 지속적 높은 발생 밀도를 토대로 Ullah and Lim (2015)의 추정을 뒷받침하여 주었다. 한편 스트 레스 조건 속에서 상호 발육 특성이 비교적 균일한 환경조건의 실내 결과 차이를 보일 수 있다. 기후변화와 더불어 이에 대해 가장 주요 변수로 보는 대기 중 이산화탄소의 함량 증가가 주요 환경 변화 요인인데, ShuQi et al. (2017)의 꽃노랑총채벌레 연 구를 보면 이산화탄소 함량이 증가하면, 꽃노랑총채벌레의 경 우 생식 기간이 길어지고 산란수의 증가를 유도하는 반면 대만 총채벌레의 경우 오히려 발육과 생식에 감소 현상을 나타냈다. 따라서 야외의 다양한 조건의 물리적 환경 변화 속에서 이들 사 이의 상대적 밀도는 차이는 획일적이지 않을 수 있다. 본 연구 에서 같은 안동지역이지만 두 총채벌레의 상이한 발생 밀도는 이들 시설재배지 주변의 상이한 생물적 및 물리적 환경에 차이 에 따라 설명될 수 있다. 따라서 시설 고추재배지에서 발생하는 총채벌레는 이들 두 종이지만 상대적 발생 밀도 지역에 따라 충 분히 달라질 수 있다. 이러한 결과는 Ko et al. (2013)이 밝힌 노 지에서는 대만총채벌레 그리고 시설재배지에서 꽃노랑총채벌 레가 우점한다는 일반적 결론에 대치되는 결과를 본 연구는 제 시하고 있다.

대만총채벌레는 1971년 국내에서 최초 보고된 이해 토착종 으로 분류되고 있지만, 꽃노랑총채벌레는 1993년 제주 지역에 서 최초 발견 이후 국내 전역으로 퍼져나간 침입종으로 알려졌 다(Woo and Paik, 1971;Lee et al., 2001). 동소성(sympatric)을 보이는 이들 두 종은 기주 범위 및 발생 시기가 유사하여 국화 와 같은 화훼류 및 딸기와 고추의 과채류에 직접 가해 피해 및 토스포바이러스와 같은 작물병을 전달하는 매체로서 작물 피 해를 가중하고 있다(Zhang et al., 2007;Lim et al., 2013). 실제 로 TSWV 감염이 주원인인 고추 칼라병이 안동 지역의 시설재 배지에서 정식 초기부터 발견되었다. TSWV의 감염은 총채벌 레에 의해 이뤄지기 때문에 이 시기에 발생하는 대만총채벌레 또는 꽃노랑총채벌레에 의해 유묘기 또는 정식 초기에 고추에 바이러스를 옮겼을 것으로 추정된다. 이러한 가정에는 월동한 총채벌레가 미지의 감염 기주에서 미리 TSWV를 획득하여 전 파했을 것으로 추정된다. 겨울기간 고추를 재배하지 않기 때문 에 이 바이러스의 기원은 시설재배지에 자생하는 잡초가 대상 으로 여겨진다. 실제로 Groves et al. (2001)은 겨울기간 자생하 는 3종의 잡초에서 TSWV에 감염된 총채벌레를 보고하고 이 들이 다음 해 바이러스 병 매개를 유발한다고 보고하였다. 반면 에 자생 잡초가 겨울기간 자생하지 않을 때에는 오히려 재배지 주변에 버려진 병든 작물체로부터 기원했다는 보고도 있다 (Okazaki et al., 2007). 즉 월동하는 병든 기주로부터 이듬해 총 채벌레의 보독이 이뤄지고 이를 통해 본 연구에서 관찰된 고추 칼라병의 초기 감염이 이뤄졌을 것으로 사료된다. 실제로 시설 재재배지에 월동하는 잡초를 제거한 경우 TSWV 감염율이 낮 아졌다는 국내 보고(Ko et al., 2013)는 이러한 TSWV와 총채 벌레의 월동 연결 고리를 뒷받침하여 주고 있다.

총 9종의 총채벌레가 현재까지 TSWV 영속전파의 매개 곤 충이다(Rotenberg et al., 2015). 여기에는 국내에 서식하는 종 이 꽃노랑총채벌레, 대만총채벌레 그리고 파총채벌레가 포함 된다. 국내에서 국화에 발생한 총채벌레 가운데 TSWV를 매 개하는 종을 살펴보면 꽃노랑총채벌레와 대만총채벌레 모두 가 보독충으로 확인된바 있다(Yoon et al., 2020). 본 연구는 이 가운데 꽃노랑총채벌레를 이용하여 이 바이러스의 체내 증식 을 분석한 결과 유충 시기에 섭식된 TSWV가 체내 증식된 반 면 성충은 감염은 되지만 증식되지 않는다는 기존의 결과 (German et al., 1992)를 뒷받침하였다. TSWV가 꽃노랑총채 벌레의 미성숙 시기 발육 및 성충 시기 수명 및 생식에 영향을 주어 바이러스 자신의 전파에 유리하게 하는 것으로 알려졌다 (Shalileh et al., 2016). 즉, 유충 시기에 TSWV에 감염된 꽃노 랑총채벌레는 성충 시기에 비감염 기주를 선호하는 것으로 알 려지고 있으며, 여기서 수명을 늘리고 탐침 활동을 증가시키고 (Stafford et al., 2011) 산란력을 증가시켜 보다 많은 바이러스가 식물체에 전파되도록 기주 생리를 조절한다. 그러나 바이러스의 어느 유전체가 이러한 기주 곤충의 생리를 조절하는지는 알려지 지 않고 있다.

고추 내병성 품종은 안동지역에서 이병율을 현저히 줄이는 효과를 주었다(Kim et al., 2021). 이에 따라 안동지역에 재배되 는 고추는 TSWV에 내병성인 품종을 재배하였으나 본 조사 결 과 이 바이러스에 기인된 칼라병이 지속적으로 발생하였다. 이 러한 이유는 TSWV의 유전적 다양성에 의한 변이종의 출현으 로 추정되었다. 이에 대한 근거를 제공하기 위해 안동지역 및 국내 서로 다른 지역의 TSWV의 3개 유전자 아미노산 서열을 분석하였다. 이 결과 서로 다른 지역에서 분리된 TSWV는 이들 유전자 서열에 변이를 보였다. 특별히 안동 TSWV 집단은 다른 지역 집단들과 구별되었다. 이러한 TSWV의 유전적 변이는 내 병성 고추 품종에 대해서 새로운 병원체로 자리할 수 있다는 증 거를 제시하고 있다. 과민성 반응을 통해 두 가지 고추 품종 (Capsicum chinenesis PI15225, PI159236)에서 Tsw 유전자가 TSWV에 대한 저항성 유전자로 판명되었고, 이 유전자를 통한 TSWV에 대한 내병성 고추가 널리 보급되었다(Jahn et al., 2000). 그러나 한편 저항성극복(resistance-breaking: RB) 바이러스가 출현하여 전 세계적으로 위협을 주고 있다. 이태리의 경우 2000 년도에 RB가 출현하였다고 보고했다(Roggero et al., 2002). 폴 란드의 경우 2010-2011년에 RB가 출현하면서 이듬해 2012년 에는 RB가 비교적 보편화되었다. Tsw에 대해 상응한 비병원성 유전자인 NS_S 유전자를 대상으로 지역적으로 상이한 RB 유전 자원을 모아 분석한 결과 이 부위에서는 저항성 특이적 변이를 찾지 못하였다(Almási et al., 2015). 국내에서는 2004년에 파 프리카 작물에서 최초로 TSWV 감염 기주체를 발견하였다 (Kim et al., 2004). 이후 다양한 작물에서 TSWV 감염체를 발 견하게 되면서 RB형 TSWV-P1 변이체가 2019년 안성에서 재 배되던 고추에서 출현하였다(Yoon et al., 2021). 본 연구는 4개 의 TSWV 유전자 모두에서 지역별로 상이한 아미노산 서열 변 이를 보였다. 그러나 감수성 고추와 내병성 고추 사이에 차이를 보이는 TSWV 변이체를 본 연구에서 분석하지 않았기에 아직 어느 변이체가 RB인지를 확인하기는 이르다. 추후 바이러스 변이체와 저항성 품종 사이의 병리학적 분석이 요구된다. 또한, 저항성 변이 부위만을 인위적으로 돌연변이체를 만드는 기술 의 확보도 이러한 기능적 연구에 필요하다.