매미나방 Lymantria dispar (Linnaeus, 1758) (나비목: 태극 나방과)는 다양한 수목 및 농작물에 피해를 끼치는 광식성 해충 으로서 생물지리학적으로 구북구지역(Paleartic region)에 광범 위하게 분포할 뿐만 아니라 북미대륙으로도 유입되어 산림의 막 대한 피해를 끼치고 있다(Pogue and Schaefer, 2007;Schintlemister, 2004). 매미나방은 지리적 분포와 유전적 특징의 차이로 인하여 크게 3개의 아종으로 구분한다. 즉, 유럽 및 북아메리카에 분포하 는 유럽 계통(Lymantria dispar dispar), 그리고 한국, 일본, 아무 르, 시베리아에 분포하는 Lymantria dispar asiatica와 일본 본토에 서식하는 Lymantria dispar japonica를 함께 아시아 계통으로 구 분한다(Kang et al., 2017). 유럽계통은 활엽수를 가해하는 반면 에 아시아계통은 침엽수도 가해할 수 있을 뿐만 아니라 암컷 성 충의 비행능력이 뛰어나기 때문에 기주범위와 서식지가 더 넓게 활동함으로서 산림부터 농경지, 도심지까지 이동하여 피해를 끼 친다(Keena et al., 2001;Limbu et al., 2017).

아시아 계통 매미나방은 국내 토착해충으로서 지역에 따라 돌발적으로 대발생한 사례가 있다(Koh, 2014;Jung et al., 2020). 특히, 2019년 이후로 경기도, 충청도, 경북 북부지역에서 대발 생하여 참나무 등 활엽수뿐만 아니라 일본잎갈나무, 리기다소 나무등 침엽수의 피해가 심했다(Jung et al., 2020;Choi et al., 2021). 매미나방의 피해는 산림뿐만 아니라 인근지역 도심 공 원에도 유충 및 나방이 대발생하여 도시민의 정서적 피해를 끼 치기도 했다. 또한 산림 발생지 주변 농경지로의 유입빈도가 높 아지면서 과수 등 농작물의 피해가 예상된다. 매미나방의 도발 적 발생에 대한 예찰 분석 및 종합적 방제대책이 절실하다.

미국이 경우, 1869년 동북부의 메사추세츠주에 유입된 이후 매미나방 관리를 위하여 다양한 방제방법을 개발하여 적용한 바 있다(Mcmanus and Csóka, 2007). 최근에는 환경보호 및 생 태계 보존을 위하여 기존 화학적 방제를 줄이고 생물적 방제 적 용 사례가 증가하고 있다(Elkinton et al., 2019;Liebhold et al., 2021;Mannu et al., 2020). 오래전에 기생성 천적으로서 알기 생벌인 짚시알깡충좀벌[Ooencyrtus kuvanae (Howard)]과 짚 시나방벼룩좀벌(Anastatus japonicus Ashmead)등을 아시아에 서 도입한 적이 있다(Crossman, 1917;1925). 또한, 병원성 천적 으로서 곤충병원성 곰팡이인 Entomophaga maimaiga, 곤충병원 성 세균인 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, baculovirus인 매미나방 핵다각체병바이러스(Lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus, LdMNPV) 등을 활용하여 방제효과를 증대한 바 있다(Blackburn and Hajek, 2018).

LdMNPV는 매미나방 유충에 특이적으로 감염하는 바이러스 로서 제재(Gypchek, USDA)로 개발되어 실용화된 적이 있다 (Cunningham and Kaupp, 1995). 또한 유럽 계통과 아시아 계통 의 매미나방에 관해서 LdMNPV의 살충활성을 비교 분석하였다 (Harrison et al., 2016). 최근 여러 국가에서 LdMNPV의 다양한 계통이 발견되고 감염율 및 살충활성의 다양성이 제시된 바 있다 (Gencer et al., 2018). 국내에서도 토착 매미나방의 LdMNPV 유 전자 및 살충활성을 비교분석한 바 있다(Shim et al., 2003). 그러 나, 국내 매미나방 LdMNPV의 지역적 발생, 감염율 및 유전적 다양성 등 다양한 특징에 대한 연구는 부족한 실정이다.

본 연구에서는 국내 여러 지역에서 채집한 매미나방 유충 및 실내 사육 개체들을 대상으로 LdMNPV 감염율 및 유전적 다양 성을 비교분석하였다. 그리고 국내 매미나방 방제를 위하여 LdMNPV를 생물적 방제인자로 적용 가능성을 진단하였다.

재료 및 방법

매미나방 채집 및 인공사육

2021년 국내 12 지역에서 매미나방 알집 및 유충을 채집하 여서 계대 사육을 실시했다. 2021년 3월에 채집한 알집은 실온 에서 부화를 유도하였다. 부화한 유충은 3령충까지 페트리 디 쉬(35 × 10 mm) (SPL, Pocheon, Korea)에 키웠고 그 이후 노숙 유충은 조금 큰 사육용기(60 mL) (SPL, Pocheon, Korea)를 사 용하여 개별로 사육하였다. 매미나방 유충의 인공먹이 F9630B (Frontier Scientific, Newark, USA)를 제조하여 1 ~ 2일에 한번 씩 신선한 먹이를 제공하였다. 번데기는 천장에 그물망이 있는 플라스틱 상자(72 × 72 × 100 mm) (SPL, Pocheon, Korea)를 사용하였다. 사육상자 내에 암수 한 쌍의 성충을 넣고 산란을 유도하였다. 성충 사육상자의 천장에 핸드타올로 덮었고, 상자 벽면에는 72 × 100 mm 골판지를 넣었다. 매미나방 사육실은 25°C ± 1°C, 40-60% RH, 12:12h (Light:Dark) 조건을 유지하 였다. 사육기간 중에 바이러스 감염증상을 보이며 죽은 유충은 70% 알코올에 넣은 후 -20°C에 보관하였다(Fig. 1A).

LdMNPV 분리 및 정제

바이러스에 의해 죽은 매미나방 LdMNPV를 정제하기 위해 매미나방 유충을 0.1% SDS (1 ml/larva) 용액에 넣고 파쇄봉을 이용하여 분쇄한 후 4°C 냉장고에서 1일 보관했다. 하루 경과 한 용액을 솜과 60 ml 주사기를 이용하여 곤충의 잔해물과 용 액을 분리한다. 25°C에서 3,600×g로 10분 동안 원심분리 후 상 층액을 제거하고 0.5% SDS와 0.3M NaCl 용액도 같은 방법으 로 재현탁후 원심분리를 했다(Ahmad et al., 2018). 마지막으로 상층액을 제거한 침전물을 증류수를 넣어 4°C에 보관했다. 현 탁한 용액에서 Cheng et al. (1990)의 방법을 참조하여 Polyhedral occlusion body (POB)를 다음과 같이 순수분리했 다. 보관한 현탁액을 2,500 × g로 10분간 원심분리하여서 상층 액을 제거 후 침전물과 증류수를 재현탁했다. 재현탁한 용액을 40-60% sucrose 용액을 이용하여 sucrose gradients로 1,500 × g로 30분간 원심분리했다. 원심분리 후 튜브의 중간에 확인된 흰 밴드를 추출하여서 증류수로 희석후 2,500 × g로 30분간 원 심분리하여 sucrose 용액을 제거하고 증류수로 재현탁 후 -20°C 에 보관했다. 분리된 POB를 확인하기 위해 혈구계산판(Hemocytometer) 을 이용하였다(Fig. 1B).

LdMNPV genomic DNA 추출 및 증폭

LdMNPV의 감염증상이 있는 매미나방에서 DNA mini kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하 였다. PCR을 수행하기 위해 NanoPhotometer^TM (ImplenGmbH, Schatzbogen, Germany)를 이용하여 농도를 측정하였다. 두개 의 LdMNPV 유전자 증폭을 위한 프라이머 쌍은 다음과 같다: polyhedrin (polh)의 forward primer 5’-GCCAAGCGCCAA AAGCACTT-3’와 reverse primer 5’-AGGCGTGATCGTCG TTTAG-3’, late expression factor-8 (lef-8)의 forward primer 5’-CTCAAGTGCGGAATGTAGG-3’와 reverse primer 5’-AGC TTCTTCCACGGCGAG-3’ (Harrison et al., 2016). PCR 혼합 액은 SolgTM2x TaqPre-Mix (Solgent, Daejeon, Korea) 15 μl, 각 프라이머 2 μl, DNA 용액 11 μl (100 ng)으로 전체 30 μl 양 으로 PCR을 진행하였다. PCR 반응은 초기반응(95°C, 5분), 35 cycles (95°C, 60초; 55°C, 60초; 72°C, 60초) 그리고 말기반응 (72°C, 5분)으로 진행하였다. 진행 후 PCR 산물은 1.5% Agarose gel을 이용하여 전기영동으로 분리하고 Wizard PCR Preps DNA purification system (Promega, Madison, WI, USA)를 이 용하여 DNA를 정제하였다.

LdMNPV 유전자 염기서열 분석

정제된 DNA의 염기서열은 BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 으로 솔젠트(대전, 한국)에서 양방향으로 분석하였다. Bioedit 7.2.5 프로그램을 이용하여 정리하였고, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Genbank database에서 BLASTN algorithm 방법으로 유사성을 분석하였고 각각의 유전 자 서열은 GenBank database에 등록하였다(Table 1). Maximum likelihood (ML) 분석은 Bioedit 7.2.5과 MegaX 프로그램을 이 용하였으며, 이때 LdMNPV (NC_001973) 염기서열을 기준으 로 lef-8유전자는 49607 - 50238 (632 bp) 영역을 사용했으며, polh 유전자는 551 - 1345 (465 bp) 영역을 사용하였다. HKY (Hasegawa-Kishino-Yano) model 계통분석방법으로 1,000회 의 bootstrapping을 실시하였다(Felsenstein, 1985). LdMNPV 의 Minimum Spanning Network (MSN) haplotype은 PopART - 1.7 프로그램으로 수행하였다(Bandelt et al., 1999).

결 과

야외 채집한 매미나방의 천적

2021년 3월 예천에서 채집한 매미나방 알집들을 실내 사육 한 결과 알집에서 많은 기생벌들이 우화하였고 형태적으로 진 단해 본 결과 2종으로서 짚시나방벼룩좀벌(Anastatus japonicus Ashmead, 1904)과 짚시알깡충좀벌[Ooencyrtus kuvanae (Howard, 1910)] 이었다(Fig. 1G, H). 또한, 2021년 4-5월 예천에서 채집 한 유충들을 관찰해 본 결과 곤충병원성 LdMNPV, 곤충병원 성 곰팡이인 Entomophaga maimaiga Humber, Shimazu & R.S. Soper, 그리고 유충의 기생성 천적인 집시나방기생파리[Parasetigena silvestris (Robineau-Desvoidy, 1863)]가 발견되었다 (Fig. 1C-F). 매미나방 발생지에서는 LdMNPV 및 E. maimaiga 에 의해서 죽은 유충의 사체들이 혼재되어 나무 줄기에 수없이 걸려 있는 모습이었다. LdMNPV에 감염되어 죽은 개체들은 역V자 모양으로 걸려있었고 곤충병원성 곰팡이에 의해서 죽은 개체들은 머리를 아래로 하고 매달려 있는 모습이었다(Fig. 1A, C). 또한, 죽은 사체들의 몸 표면에 기생파리의 알이 산란되어 있는 모습을 쉽게 관찰할 수 있었다(Fig. 1E).

매미나방 인공사육

예천에서 채집한 매미나방 알집들을 25°C에서 40일 동안 관 찰한 결과 부화기간은 5-15일이었고 부화율을 52.3-99.7%로 다양했으며 평균 부화율은 79.64%이었다(미보고 자료). 특히, 많은 알집들로 부터 알기생벌이 우화했으며 우화기간은 10-34 일, 우화율은 10.6%이었다. 또한, 부화한 매미나방 1령 유충들 을 인공사육하는 과정에서 NPV 감염증상이 심하게 나타났다. 총 403마리 중 321마리(79.65%)는 움직임이 둔하고, 먹이을 잘 먹지 못했으며, 이와 같은 증상 이후 1 ~ 2일 이내에 몸이 녹 아내리는 듯한 NPV 감염증상이 나타나며 사멸했다(Black and Hajek, 2018). NPV 감염율은 어린 유충보다 5-6령일때에 56.58%로 가장 높았다(Table 2).

매미나방의 유충단계의 령 수는 다양하게 나타났다. 암컷은 유충의 령 수가 6령, 또는 7령인데 6령이 많았고 수컷은 5령, 6 령, 7령인데 6령이 가장 많았다 (Table 3). 매미나방의 총 수명 은 유충의 령 수가 많을수록 길었다. 즉, 암컷의 유충 령 수가 6 령 또는 7령일 경우에 각각 75.40일, 79.0일이었다. 수컷의 유 충 령 수가 5령, 6령, 7령일 경우에 각각 73.08일, 80.43일, 87.50일이었다(Table 3).

LdMNPV 진단

LdMNPV에 감염된 매미나방 5령 유충의 1차 추출물을 sucrose gradients로 원심분리 후 50% sucrose에서 흰 밴드를 확인하였다. 추출한 흰 밴드는 증류수로 재현탁 후 원심분리기 를 통해 POB로 정제하였다. POB는 혈구계산판내의 격자[0.05 × 0.05 mm (0.25 nL)]의 면적으로 측정하였다(Fig. 1B). 측정 을 토대로 매미나방 4령 유충에게 1 × 10⁵ POB를 접종한 5 × 5 mm의 인공먹이를 제공하였다. 매미나방이 POB가 접종된 먹 이를 먹은 후 일반 인공먹이를 제공하였으며, 이후 LdMNPV 에 의해 죽은 매미나방을 관찰하였다.

매미나방 바이러스 조사 및 분석

2021년 국내 12 지역에서 채집한 매미나방 유충에서 LdMNPV 가 확인되었다. LdMNPV의 유전적 다양성을 결정하기 위하여 지역별 3개체를 대상으로 2개의 유전자인 lef-8와 polh를 이용 하여 maximum likelihood (ML) 방법으로 분석하였다. 국내 LdMNPV의 lef-8 유전자 변이율은 0.00 - 0.80%이며, 2015년 NCBI의 등록된 한국 개체의 염기서열(KF695050)과 0.48 - 1.12%의 차이를 나타냈다(Table S1). NCBI에 등록된 36개의 염기서열과 비교 결과 변이율이 0.00 - 9.28%이었다. 특히, 용인 (OK072706)과 평창(OK072704) 개체를 제외한 7개체는 일본 개체(LC109268)와 0.00 - 0.16%의 변이율이 가장 낮고, 터키 (KP939236)와 8.64 - 8.96%으로 가장 높았다(Fig. 2, Table S1). LdMNPV의 polh 유전자 변이율은 0.00 - 0.86%이었다. 그러나, 2015년 NCBI에 등록된 한국의 LdMNPV의 polh 염기서열 (KF695050)과 비교한 결과 0.86 - 1.08%의 차이를 나타냈다 (Table S2). NCBI에 등록된 37개의 염기서열과 비교 결과 변이 율이 0.00 - 4.09%이었다. 특히, 예천(OK072707)과 용인 (OK072711)을 제외한 국내 10개체는 일본 개체(LC109265)와 0.00%로 변이율이 가장 낮았고, 터키 개체(KP939244)와 3.01 - 3.23%으로 가장 높았다(Fig. 3, Table S2).

LdMNPV의 lef-8와 polh의 haplotype을 분석해 본 결과 lef-8 유전자는 러시아, 루마니아, 스페인, 일본의 일부 개체들 이 아시아와 유럽 개체들과 일부 혼재되어 있지만 미국, 프랑 스, 폴란드, 터키는 유럽 지역을 형성하였으며, 인도, 중국, 한국 은 아시아 지역을 형성하였다. 그와는 반대로 polh 유전자는 유 럽 지역과 아시아 지역이 구분이 되어 있지 않았다(Fig. 4). 특 히, 터키에서 채집한 LdMNPV의 lef-8과 polh는 다른 나라의 샘플과 달리 가장 독특한 halotype으로 나타났다.

고 찰

2021년 경북 예천의 매미나방 발생지역을 조사해 본 결과 매 미나방 알집과 유충들은 다양한 기생성 및 병원성 천적들에 의 해서 기생 또는 감염되어 있었다. 매미나방 알집에는 짚시알깡 충좀벌과 짚시나방벼룩좀벌 2종이 발견되었다. 또한, 유충들에 는 곤충병원성 미생물 천적인 핵다각체병바이러스와 곤충병원 성 곰팡이의 감염으로 인해서 죽은 개체들이 아주 많았다. 이러 한 개체들에는 기생성 파리인 집시나방기생파리의 알들이 산란 된 개체들도 많이 발견할 수 있었다(Fig. 1). 또한, 2021년 국내 다양한 지역 (경기도, 강원도, 충청도 및 경상도)에서 채집한 유 충들을 조사해 본 결과 모든 지역에서 LdMNPV로 인해서 죽은 유충들이 관찰되었다. 즉, 2021년에 관찰된 매미나방 개체군에 는 천적의 활동이 왕성했을 것으로 판단된다. 이러한 현상은 그 이전(2019-2020)에는 관찰되지 않았던 현상이며 지난 2년간 매 미나방의 돌발적인 발생 증가로 인해서 2021년에는 기생성 및 병원성 천적들의 활동이 증가한 것으로 판단된다.

일반적으로 25°C에서 사육할 경우에 사충율은 2% 정도이 며, 1령부터 번데기까지 사육기간은 암컷 46.7일, 수컷 43.2일 소요된고 보고한 바 있다(Lyu, 2015). 그러나, 본 조사에서 살 펴본 바와 같이 예천에서 채집한 알집들에서 부화한 유충을 인 공사육해 본 결과 유충 성장과정에서 많은 유충들이 LdMNPV 감염에 의해서 사멸하였다. 특히, 사멸율은 어린 유충보다 5-6 령 노숙유충들에서 높게 나타났다. 즉, 야외에서 채집한 매미나 방의 알집들은 이미 LdMNPV에 감염되어 있는 상태인 것으로 판단된다. Myers et al. (2000)에 의하면 매미나방 알집의 0.5-2% 는 LdMNPV에 감염되어 있으며 경란전염이 가능하다고 보고 한 바 있다. 본 연구에서도 매미나방 알에서 추출한 DNA 샘플 에서 LdMNPV를 PCR 진단할 수 있었다(미보고 자료). 또한, 사육기간중 LdMNPV의 병원성 증상은 어린 유충보다 5-6령 노숙유충에서 심하게 나타났다. 이러한 현상는 2021년 야외 관 찰시 어린유충시기인 5월초보다 노숙유충시기인 6월초순경에 LdMNPV에 의해서 죽은 유충 사체가 훨씬 많았다. 발달단계 에 따른 LdMNPV의 병원성에 대한 차이는 국내에서도 보고된 바 있다(Lee and Robert, 2009).

국내 다양한 지역의 LdMNPV를 채집하여 염기서열을 비교 해 본 결과 일부 지역에서 변이율이 있었지만 모두 0.9% 이내 로 나타났다. 그러나, 2015년에 국내에서 보고된 LdMNPV (KF695050)는 본 연구에서 조사한 LdMNPV의 변이율인 0.9%보다 더 높게(lef-8은 1.12%, polh 1.08%) 나타났다. 이러 한 차이는 LdMNPV가 시간이 지남에 따라서 변할 수 있다는 가능성을 제시한다. 국내 LdMNPV는 유럽 샘플보다 주변국인 중국와 일본의 LdMNPV와 가장 유사했다. 그러나, 터키의 LdMNPV는 다른 나라의 샘플과 달리 유전적 다양성이 가장 높 았다. 이러한 다양성은 Gencer et al. (2018)에 의하면 매미나방 에 대한 병원성이 다른것을 시사한바 있다. 따라서, LdMNPV 는 잠재적 다양성이 높을 가능성을 제시하며, 이에 따른 매미나 방에 대한 병원성이 다를 것으로 추측되어진다.

LdMNPV의 계통에 따라서 다양한 유전적 특징이 차이가 날 수 있다. Harrison et al. (2016)은 한국, 일본 및 러시아에서 채집한 LdMNPV는 미국에서 현장에 사용된 Gypchek의 LdMNPV보다 살충율이 더 높았다고 보고한 바 있다. 국내 LdMNPV 계통들에 대한 다양한 살충효과를 분석하여 매미나방 방제를 위한 우수 살 충계통 선발 및 실용화에 활용할 수 있을 것이라고 기대된다.