담배가루이(Bemisia tabaci (Gennadius))는 전세계적으로 문제가 되고 있는 흡즙성 해충으로서 약 900종 이상의 식물을 기주로 삼으며 체관부 흡즙, 감로 배설을 통한 광합성 효율 저 해 및 토마토황화잎말림바이러스, 카사바갈색줄무늬병 바이 러스 등의 식물 바이러스를 매개하여 경제적으로 큰 피해를 끼 치고 있다(Byrne and Bellows, 1991). 국내에서는 1998년 충북 진천에서 최초로 보고되었으며 단기간 내에 전국적으로 분포 가 확산되었다(Lee et al., 2000). 고온다습 환경을 선호하는 특 성 때문에 온실에서 큰 피해를 주고 있으며 빠른 저항성 발달 로 인해 대표적인 난방제 해충으로 꼽힌다(Naveen et al., 2017;Wagner, 1995). 세계적으로 MEAM1 (Middle East-Asia Minor 1, biotype B) 및 MED (Mediterranean, biotype Q)계통을 포함 한 다양한 계통의 약제 저항성이 보고되어 왔으며(Kontsedalov et al., 2012;Pan et al., 2011;Perring, 2001) 국내에서도 여러 약제에 대한 저항성 발달이 보고되고 있다(Lee et al., 2012). 살충제의 무분별한 오남용은 약제 저항성 발달을 가속화시키 므로 정확한 저항성 진단을 바탕으로 한 정밀 방제가 시급한 실 정이다.

본 실험에서는 국내 온실에 분포하고 있는 담배가루이의 약 제 저항성 정도를 파악하기 위해서 두가지 기법으로 접근하였 다. 잔류접촉법(residual contact method) 기반 생물검정을 통 해 지역별 담배가루이 개체들의 실제 약제 저항성 정도를 확인 하였으며 분자마커 기반 정량적염기서열분석법(quantitative sequencing)을 통해 개체군 내 저항성 돌연변이 비율을 확인하 여 이를 저항성 정도와 비교하여 저항성 분자마커의 현장 적용 가능성을 검토하였다.

재료 및 방법

담배가루이 채집

채집은 2020년 6월부터 10월까지 전국 7개도(경기, 충북, 충남, 전북, 전남, 경북, 경남 및 제주) 12지역(평택, 진천, 공주, 논산, 익산, 임실, 보성, 예천, 구미, 진주, 김해, 서귀포)의 온실 을 대상으로 수행되었다(Table 1). 성충 암컷 담배가루이를 토 마토, 오이, 애호박, 고추 기주에서 채집하였으며 저항성 점 돌 연변이 비율 조사를 위해서는 채집된 담배가루이를 75% 에탄 올에 넣어 사용 전까지 -20°C에 보관하였다. 농촌진흥청에서 10년 이상 약제 무처리 누대사육을 해온 담배가루이 MED 계 통(RDA)을 제공받아 지역 샘플 대비 상대적 감수성 계통으로 실험을 수행하였다.

생물검정 기반 저항성 조사

저항성 진단을 위해 잔류접촉법 기반 생물검정을 수행하였 다. 약제는 담배가루이 방제용으로 등록되어 있는 dinotefuran, spinosad, emamectin benzoate, chlorfenapyr 및 bifenthrin을 대상으로 하였다. 각 약제의 원제는 100% 아세톤에 희석하여 5 ml 크기의 유리 바이엘에 100 μl씩 도포 후 후드 내에서 회전 증발기를 통해 건조하였다. 각 약제 별 3반복씩 수행하였으며 한 반복 당 10-15마리의 담배가루이 암컷 성충(RDA 계통의 경우 우화 후 3일차의 성충 사용)을 흡충기를 통해 유리바이엘 에 접종하였다. 수분 제공을 위해 뚜껑 안쪽에 부착된 2 mm × 2 mm 크기의 거름종이에 1 μl의 물을 도포하였다. 담배가루이 가 접종된 바이엘은 25°C 암조건에 보관되었으며 모든 약제에 대해 접종 8시간 후 사충률을 확인하였다.

저항성 진단농도 설정을 위해 RDA 계통을 대상으로 잔류 접촉법을 수행하였다. 약제 별 처리 농도는 emamectin benzoate: 0, 1, 10, 250 mg/kg; chlorfenapyr: 0, 0.2, 2, 8, 20 mg/kg; dinotefuran: 0, 20, 100, 500, 2,000 mg/kg; bifenthrin: 0, 1, 10, 100 mg/kg; spinosad: 0, 1, 10, 50 mg/kg이었다.

저항성 점 돌연변이 비율 조사

유기인계/ 카바메이트계 약제의 작용점유전자인 acetylcholi- nesterase (ace1, gene ID: LOC109029639) 1, 네오니코티노이 드 약제의 작용점유전자인 nicotinic acetylcholine receptor β 1(nAChRβ1. gene ID: LOC109043254), 피레스로이드계 약 제의 작용점유전자인 voltage gated sodium channel (vgsc, gene ID: LOC109039786) 상에 존재하는 저항성 돌연변이의 개체 군 내 빈도를 PCR 및 정량적염기서열분석법(quantitative sequencing) 을 통해 조사하였다. ace에서는 담배가루이에서 유 기인계 저항성을 유발하는 것으로 보고된 F392W 돌연변이를 (Alon et al., 2008), nAChRβ1에서는 담배가루이에서는 보고 된 바 없지만 복숭아혹진딧물(Myzus persicae) 및 목화진딧물 (Aphis gossypii)에서 네오니코티노이드계 약제에 저항성을 유발하는 것으로 보고된 R81T 돌연변이에 상응하는 R79 상의 돌연변이 여부를 확인하였다(Bass et al., 2011;Kim et al., 2015). vgsc에서는 담배가루이에서 피레스로이드계 약제에 저항성을 유발하는 것으로 보고된 L925I/T929V 돌연변이 비율의 합을 확인하였다(Morin et al., 2002;Roditakis et al., 2006).

담배가루이 성충 암컷 30마리에서 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiazen, Hilden, Germany)를 이용하여 게놈DNA를 추출하 여 ND-1000 Nanodrop (NanoDrop, Wilmington, NC, USA) 을 통해 정량하였다. 10 ng의 게놈DNA를 Table 2에 있는 조건 으로 Ex Taq polymerase (TAKARA Korea Biomedical Inc., Seoul, Korea)를 이용하여 PCR하였고 그 결과물을 Monarch PCR & DNA cleanup kit (NEB, Ipswich, MA, USA)를 이용 하여 PCR 정제 후 염기서열분석을 진행하였다. 염기서열분석 결과에서 해당 돌연변이 위치의 피크 비율을 계산하여 개체군 내 저항성 돌연변이 비율을 추정하였다.

담배가루이 계통 조사

추출한 게놈DNA를 통해 각 지역샘플이 MED와 MEAM1 중 어느 계통에 속하는지 조사하였다. Forward primer로는 F-BQ-880(5′-TGGAATAGATGTAGATACTC-3′)를 reverse primer로는 R-BQ-1460(5′-CTTACACCAAGCCTAAATCTTACTA- 3’)를 이용하여 mtCOI 유전자의 부분 염기서열(555 bp)을 증폭시켰다(Tang et al., 2020). PCR 조건은 95°C 3분 후 95°C 30초, 52°C 30초, 72°C 1분의 조건으로 34회 반복 증폭시 키고 72°C로 5분간 처리하였다. PCR 결과물은 정제 후 R-BQ- 1460 프라이머로 염기서열 분석 후 NCBI BLAST (https:// blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 통해 계통을 확인하였다.

결과 및 고찰

약제 5종에 대한 감수성 계통의 저항성 정도 평가

상대적 감수성 계통인 RDA의 약제 5종에 대한 저항성 정도 를 확인하였다(Table 3). 각 약제의 LC₉₀ 순위는 dinotefuran (19,812 ppm), emamectin benzoate (6,990 ppm), spinosad (263 ppm), chlorfenapyr (130 ppm), bifenthrin (23.1 ppm) 순으로 나타났다. dinoterfuran의 높은 LC₉₀ 값은 침투이행성은 높으 나 접촉 독성은 낮은 약제의 특성에 기인한 것으로 보인다(Qu et al., 2017).

담배가루이 지역 샘플의 잔류접촉법 기반 저항성 정도 평가

총 12지역의 온실(Fig. 1)에서 채집한 담배가루이를 대상으 로 잔류접촉법을 통해 저항성을 평가하였다(Fig. 2). 각 약제의 진단농도는 RDA 계통의 감수성 정도를 기반으로 설정하였다. chlorfenapyr, bifenthrin, spinosad는 RDA 계통 LC₉₀의 2배 농 도를 진단농도로 설정하였으며 emamectin benjoate 및 dinoterufran은 높은 LC₉₀ 농도로 인해 각각 LC₅₀의 2배, 20배를 진 단농도로 설정하였다. 가장 높은 저항성 발달을 보인 약제는 chlorfenapyr로 진단농도에서 전국 평균 14%의 낮은 사충률 을 보였으며 제주 계통의 경우 사충률이 0%로 높은 저항성을 보유한 것을 확인하였다. 가장 높은 사충률을 보인 약제는 spinosad로 87%의 높은 지역 평균 사충률을 나타내었다. dinotefuran과 emamectin benzoate는 타 약제에 비해 상대적으로 낮은 진단농도로 처리하였음에도 불구하고 각각 71%, 43%의 사충률을 보였다.

지역별로 저항성을 비교해봤을 때 시험 약제에 대해 전반적 으로 가장 높은 저항성을 보인 계통은 예천 계통이었으며 가장 낮은 저항성을 보인 계통은 김해 계통이었다. 예천 계통은 spinosad를 제외한 모든 약제에 50% 미만의 사충률을 보여준 반면 김해 계통은 모든 약제에 대해 50% 이상의 높은 사충률 을 보여주었다. 익산과 임실 계통은 합성 약제를 사용하지 않 았음에도 chlorfenapyr에 사충률 2.7%와 2.3%로 높은 저항성 을 나타냈다. 이는 chlorfenapyr 저항성이 한번 확보되면 선택 압 없이도 장기간 유지될 수 있음을 시사한다.

담배가루이 지역 샘플 계통 조사

담배가루이 지역 샘플은 모두 MED 계통으로 확인되었다. 이는 국내에서 MEAM1 계통이 사라지고 있는 동향과 일치한 다(Lee et al., 2014;Park et al., 2012). MED 계통은 MEAM1 계통에게 약제 선택압이 없는 경우 경쟁에서 밀리나 네오니코 티노이드계 약제 처리하에서는 높은 저항성으로 인해 경쟁우 위를 가지는 것으로 알려져 있다(Horowitz et al., 2005). 따라 서 MED계통의 우위로부터 국내 담배가루이의 네오니코티노 이드계 약제 저항성이 전반적으로 높음을 예상할 수 있다. 지 역 샘플 mtCOI 유전자 부분 염기서열은 Supplementary information에 첨부하였다.

담배가루이 지역 샘플의 분자마커 기반 저항성 비율 조사

상대적 감수성 계통 및 지역 계통에서 유기인계, 피레스로 이드계, 네오니코티노이드계의 표적 유전자인 ace1, vgsc, nAChRβ1 상의 저항성 점 돌연변이의 비율을 조사하였다(Table 4). 해당 염기서열은 Supplementary information에 첨부하였다. ace1 상의 저항성 점 돌연변이인 F392W는 모든 계통에서 100% 의 빈도로 존재하는 것으로 확인되었으며 vgsc 상의 돌연변이 인 L925I/T929V의 합 또한 대부분의 지역에서 100%에 육박 하는 것으로 나타났다. 이는 국내 담배가루이 계통에서 이들 저항성 돌연변이가 포화 되었음을 시사한다. 유기인계 약제의 사용량 감축에 따른 도태압의 현저한 감소에도 불구하고 ace1 F392W 돌연변이가 포화된 것으로 관찰되므로 이들 돌연변이 는 낮은 적응 비용(fitness cost)을 가진 것으로 추정되며 개체 군 내에서 완전히 소멸되기까지는 상당한 시간이 소요될 것으 로 예상된다. 네오니코티노이드계 약제의 표적유전자인 nAChRβ1 상에서는 저항성 돌연변이가 발견되지 않았지만 예천, 공주 등의 생물검정 결과에서는 저항성을 지닌 것으로 보아 분 해대사관련 유전자들의 발현이 저항성 발달에 영향을 미치고 있는 것으로 추정된다(Karunker et al., 2008). 따라서 대사저 항성 관련 분자마커의 발굴을 통한 네오니코티노이드 저항성 의 지속적 모니터링이 시급한 것으로 보인다.

종합하자면, 본 연구에서는 국내 온실에서 발생하는 담배가 루이의 약제 저항성을 생물검정과 분자마커를 통해 진단하였 다. 생물검정 결과, 지역별, 약제별로 그 정도가 상이하나 전국 적으로 모든 약제에 대해 저항성이 발달해 있으며 네오니코티 노이드계 약제에 높은 저항성을 지닌 것으로 알려진 MED 계 통의 비율이 높음을 확인하였다. 저항성 점 돌연변이의 비율을 조사한 결과, 유기인계 및 피레스로이드계 약제에 대한 저항성 점 돌연변이는 이미 국내에 포화 상태인 것으로 밝혀졌으므로 이들 약제의 사용에 대한 규제가 필요할 것으로 사료된다. 조 사된 모든 계통에서 돌연변이의 비율이 100%에 육박하여 실 험에 사용된 분자마커로는 지역계통의 저항성 정도를 비교할 수 없었지만 후속연구를 통해 분해대사관련 유전자 상의 분자 마커를 개발하여 저항성 진단 분자마커로서의 현장 적용 가능 성을 확인해 볼 예정이다.