아열대 및 열대성의 서반구 미주 대륙(Western Hemisphere, the Americas)이 원산인 열대거세미나방[Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797)]은 나비목 밤나방과 흰무늬밤나방아과 (Lepidoptera: Noctuidae: Amphipyrinae)에 속하는 광식성 (polyphagous)의 이동성(migratory)이 강한 해충이다(Sparks, 1979;Johnson, 1987). 2016년 원산지가 아닌 서아프리카의 나 이지리아에서 처음으로 열대거세미나방의 발생이 확인된 이후 (Goergen et al., 2016), 사하라 이남지역 대부분의 아프리카 국 가 뿐만 아니라(Nagoshi et al., 2018) 2018년 5월에는 서아시아 지역인 인도(India)에서 발생이 처음으로 확인되었고 같은 해 에 미얀마(Myanmar)와 태국(Thailand) 등 동남아시아 국가에, 그리고 2019년에는 중국(China), 한국(South Korea) 등 동북아 시아 국가들로 빠른 속도로 확산되었다(Li et al., 2019;Lee et al., 2020). 열대거세미나방은 일생에 평균 900개 이상의 알을 덩어리로 낳고 알에서 부화 후 보통 6령기의 발육 단계를 거친 다(Sparks, 1979;Johnson, 1987). 유충은 76과(family) 350여 종(species)의 식물을 가해하는 것으로 조사되었으며 그중 벼 과(Poaceae)가 106종, 국화과(Asteraceae)와 콩과(Fabaceae) 가 각각 31종 순으로 많다(Montezano et al., 2018). 주로 피해 를 주는 농작물과 목초는 옥수수, 수수, 벼, 목화, 콩, 알팔파, Bermuda grass, crabgrass 등이 보고되고 있다(Johnson, 1987;Montezano et al., 2018).

열대거세미나방은 선호하는 기주식물에 따라 종내 두 개의 기주식물계통(host strain)이 알려져 있는데, 옥수수, 목화, 수수 를 선호하는 옥수수계통(corn strain)과 벼와 다양한 목초를 선 호하는 벼계통(rice strain)으로 구분되었다(Pashley, 1986;1988;Dumas et al., 2015). 열대거세미나방의 서로 다른 기주식물계 통 사이에 교잡되어 생성된 F1 세대의 산란력(fertility)이 같은 계통끼리 교잡하여 얻어진 F1 세대 보다 유의하게 감소하였고, 또, 계통 사이 교잡에서 옥수수계통 암컷과 벼계통 수컷을 교잡 한 경우가 그 반대의 교배 경우보다 F1 세대의 산란력이 약 2배 정도 감소한 결과로부터 야외에서 두 기주식물계통간 접합 후 생식적 격리(post-zygotic reproductive isolation)가 있을 것으 로 추정되었다(Dumas et al., 2015). 그러나 열대거세미나방의 두 계통을 형태적으로는 구별할 수 없고, 에스터레이즈 알로자 임 다형성(esterase allozyme polymorphism) (Pashley, 1986) 및 미토콘드리아 시토크롬 옥시다제 1 (cytochrome c oxidase subunit 1, CO1)과 성염색체(Z-linked)에 있는 Triose phosphate isomerase (Tpi) 유전자 염기서열 차이 등이 확인되어 이들 서 열이 계통을 구별할 수 있는 마커로 개발되었는데(Levy et al., 2002;Meagher and Gallo Meagher, 2003;Prowell et al., 2004;Nagoshi, 2010;2012), 이들 유전적 마커들과 기주식물계통과 의 연관성에 대해서는 불완전한 부분이 있다(Nagoshi, 2012;Juarez et al., 2014;Nagoshi et al., 2018;2019). 따라서 본래 기 주식물 선호성으로 구별되었던 기주식물계통(옥수수계통과 벼계통)과의 혼동을 피하기 위해 CO1 SNP (single nucleotide polymorphism) 마커를 이용해 나뉘는 옥수수계통과 벼계통인 경우 각각 CO1-CS (from Corn Strain)와 CO1-RS (from Rice Strain)로 표기하고, Tpi SNP 마커를 통해 구분된 옥수수계통 과 벼계통은 각각 TpiC와 TpiR로 표기하여 사용하고 있다 (Nagoshi et al., 2019).

열대거세미나방 성페로몬을 구성하는 화합물로 (Z)-9-tetradecenyl acetate (Z9-14Ac)와 (Z)-7-dodecenyl acetate (Z7-12Ac) 는 각각 주성분과 미량성분으로 동정되었으며, 두 화합물이 열 대거세미나방 성페로몬 트랩 유인제의 미끼에 반드시 필요한 화합물들로 보고되고 이용되어 왔다(Tumlinson et al., 1986;Andrade et al., 2000;Batista-Pereira et al., 2006;Groot et al., 2008;Lima and McNeil, 2009). 그 외에 다른 미량성분으로 (Z)-9-dodecenyl acetate (Z9-12Ac)와 (Z)-11-hexadecenyl acetate (Z11-16Ac)가 보고되어, 이들이 앞의 두 성분에 추가되 었을 때 포획수를 증가시키는 결과도 있었으나(Fleischer et al., 2005;Meagher Jr et al., 2019), 다른 연구에서는 그렇지 않아 이들의 역할이 명확하게 설명되지 못하고 있다(Tumlinson et al., 1986;Meagher et al., 2013;Groot et al., 2016). 또 다른 미 량성분으로 브라질 개체군에서 (E)-7-dodecenyl acetate (E7- 12Ac)가 보고되었는데, 이 화합물을 앞의 두 필수 화합물로 구 성된 미끼 조성에 추가시켰을 때 포획수가 유의하게 증가한 경 우도 있었다(Batista-Pereira et al., 2006). 그러나 E7-12Ac는 다른 지역(미국의 플로리다와 루이지애나, 프랑스령 기아나) 개체군의 암컷에서는 검출되지 않고 있어 암컷의 성페로몬 생 산과 수컷의 유인 반응에 지역적 변이가 있음이 제안되었다 (Meagher and Nagoshi, 2013;Unbehend et al., 2014;Groot et al., 2016;Haenniger et al., 2020). Z9-14Ac와 Z7-12Ac로 구성 된 조성은 지역에 상관없이 유인효과를 보였으며 Z7-12Ac의 비율에 따라서 계통간(옥수수계통, 벼계통) 포획 효율에 차이 가 있는 것이 보고되었는데, Z9-14Ac 100%에 대해 옥수수계 통은 Z7-12Ac의 비율이 10%와 4% 보다 2% 조성일 때 포획 효 율이 뚜렷하게 높았던 반면, 벼계통은 2-10%의 상대적으로 넓 은 범위의 조성에서 유인되는 반응을 보였다(Unbehend et al., 2013). 그 외 성페로몬 성분 미끼 뿐만 아니라 트랩의 종류와 색 깔, 설치 높이, 방출제 등의 열대거세미나방의 포획 효과에 대 한 비교 연구가 있었다(Mitchell et al., 1985;1989;Tumlinson et al., 1986;Malo et al., 2004;Batista-Pereira et al., 2006).

열대거세미나방이 2019년 처음으로 국내에 침입할 것이 예 상되면서(Ma et al., 2019), 성페로몬 트랩을 이용한 초기 성충 발생 탐지가 중요하다고 판단되었다. 국내로의 침입 개체군의 발생지로 예상되는 동남아시아와 중국의 경우에 침입한 시기 가 2018년과 2019년 사이로 이들 지역에서도 아직 성충 발생 탐지를 위한 적절한 성페로몬 트랩 이용 방법이 연구될 충분한 시간적 여유가 없었다. 따라서 국내에서는 2019년 침입에 대비 하여 원산지인 미주 대륙에서 포획 효과가 보고된 열대거세미 나방 성페로몬 미끼 조성[Z9-14Ac와 Z7-12Ac의 50 : 1 조성 (Unbehend et al., 2014)]을 사용하여 성페로몬 트랩을 제주도 를 비롯한 남부지방에 설치하였다. 그러나 5월과 6월 중에는 성 페로몬 트랩에 성충 발생이 탐지되지 않았지만(Lee, G.-S., unpublished observation), 이에 앞서 실제로 2019년 6월 13일 제주특별자치도 제주시 구좌읍의 옥수수 포장에서 열대거세미 나방의 유충이 처음 발견되었고, 이후 7월 초까지 전남, 전북, 경남 등 내륙에서도 유충 발생이 확인되었다(Lee et al., 2020). 이러한 과정 중에 열대거세미나방 성충의 비래를 조기에 예찰 하기 위해 설치한 성페로몬 트랩에 대한 국내에서의 열대거세 미나방 포획 효과를 평가하는 연구가 필요하였다.

본 연구에서는 열대거세미나방 유충 발생이 확인된 고창 지 역의 옥수수 포장 주변에서 열대거세미나방 성충의 성페로몬 주성분 조성[Z9-14Ac와 Z7-12Ac의 50:1 조성(Unbehend et al., 2014)]의 미끼 내 성페로몬 함량과 트랩 종류에 따른 포획 효율성을 검토하였다. 또 위 화합물에 더해 다른 두 개의 미량 성분(Z9-12Ac와 Z11-16Ac)을 더해 만든 미끼의 포획 효율성 을 검토하였는데, 그 결과를 여기에 보고한다. 한편, 고창 지역 에 설치된 성페로몬 트랩에 포획된 성충들을 이용하여 미토콘 드리아 CO1 영역 염기서열에 대해 유전 분석을 하였는데, 이 지역에서 발생한 열대거세미나방의 종내 변이군 발생 빈도를 보고한다. 이 결과들은 향후 열대거세미나방 성충 예찰을 위한 성페로몬 트랩 연구와 국내 침입 개체군에 대한 유전적 속성을 밝혀 비래원 추적 및 방제 등 작물 피해를 대비하는 연구에 이 용될 것이다.

재료 및 방법

성페로몬 트랩을 이용한 나방류 포획

트랩의 종류와 미끼로 사용될 열대거세미나방(S. frugiperda) (fall armyworm, FAW)의 성페로몬 성분(화합물)의 조성과 함 량에 따른 포획 효과를 조사하였다. 열대거세미나방의 성페로 몬 성분 2종류 조성 미끼는 Z9-14Ac와 Z7-12Ac의 비율을 100 : 2로 만들었는데, 총 함량이 각각 300 ㎍ (2C-300)과 1000 ㎍ (2C-1000)인 미끼를 제조하였다. 성페로몬 성분 4종류 조성인 미끼는 Z9-14Ac와 Z11-16Ac, Z7-12Ac, Z9-12Ac를 100 : 8 : 2 : 1 비율로 총 함량이 1000 ㎍ (4C-1000)인 미끼를 제조하였다. 모든 미끼의 성페로몬 화합물은 hexane (Sigma-Aldrich, USA) 에 녹이고 butylated hydroxytoluene (BHT) (Sigma-Aldrich, USA)을 섞어 방출제인 7 mm 고무마개(rubber septum)에 침투 시켰다. 미끼는 실험실에서 직접 제조하거나 구매하여 사용하 였다(㈜그린아그로텍, 한국).

트랩은 ㈜그린아그로텍이 제조판매하는 델타형트랩(deltatype sticky trap, D, 적색)과 깔대기형트랩(funnel-type bucket trap, F, 녹색), 날개형트랩(wing-type sticky trap, W, 흰색) 3종 류를 사용하였다. 두 성분 조성의 함량과 트랩 형태의 포획 효 율성 비교를 위해서는 델타형트랩과 깔대기형트랩을 이용하였 고(4개 조합: 2C-300-D, 2C-300-F, 2C-1000-D, 2C-1000-F), 두 성분과 네 성분 조성 미끼의 유인성 비교에는 성페로몬 총 함량이 1000 ㎍인 미끼로 날개형트랩만을 이용하였다(2C- 1000-W, 4C-1000-W). 트랩은 T 자형 거치대(날개 길이: 좌우 각각 30 cm)에 같은 함량의 미끼를 갖는 델타형트랩과 깔대기 형트랩을 동시에 설치하거나, 다른 조성을 갖는 날개형트랩을 동시에 설치하였다(Fig. 1A).

트랩의 설치 장소는 전북 고창군 상하면 석남리의 사료용 옥 수수 포장(35°26'N, 126°28'E) 주변이었으며, 옥수수 포장 근처 (500 m 이내)에는 수단그라스, 고구마, 고추, 벼 등이 있었다. 트 랩은 3 반복 또는 5 반복으로 설치해 2019년 07월 08일부터 11 월 29일까지 1주일 간격으로 조사를 하였다. 미끼는 9월 말까지 는 2주 간격으로 교체를 하였고 10월부터는 4주 간격으로 교체 하였다. 각 트랩에 포획된 열대거세미나방 등 나방 성충들은 실 험실로 가져와 일차적으로 나방의 날개 무늬와 외부 형태를 관 찰하였으며 분자 동정을 위해 게놈 DNA 추출에 사용할 다리 또 는 더듬이 등 일부 조직을 분리한 다음 1.5 mL 튜브에 담아 분석 에 활용될 때까지 초저온냉동보관(-70℃ 이하) 하였다.

게놈 DNA 추출 및 분자 동정

성페로몬 트랩에 포획된 나방 성충의 게놈 DNA 추출을 위 해 Seo et al. (2017)의 CTAB extraction solution (iNtRON biotechnology, Inc., Korea) 방법을 적용하였으며, 최종 20 μL 멸 균된 3차 증류수에 게놈 DNA를 녹인 후 NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, U.S.A.)을 이용하여 추출된 각 나방 성충별 게놈 DNA 양을 측정하였다.

1차 확인 결과 열대거세미나방으로 분류된 나방 성충은 미 토콘드리아 시토크롬 옥시다제 1(cytochrome c oxidase subunit 1, CO1)의 전체 영역(1,531 bp)을 증폭시킬 수 있도록 본 연구 에서 제작한 열대거세미나방 CO1 증폭용 프라이머(Supplement Table 1)를 활용하였다. 중합효소연쇄반응(PCR)을 위해 0.2 mL PCR 튜브에 12.5 μL의 PrimeSTAR® GXL premix (2×) (Takara Korea Biomedical Inc., Korea)를 넣고 1 μL의 게놈 DNA와 2 μL의 정방향/역방향 프라이머(각각 10 pM) 및 9.5 μL의 멸균수를 추가하고 섞어 최종 25 μL를 만들었다. PCR 반 응을 위해 SimpliAmp^TM Thermal Cycler (Thermo Fisher SCIENTIFIC, Korea)로 98℃에서 10초 후 55℃에서 15초, 그 리고 68℃에서 20초로 총 30회 반복해서 반응시킨 후 마지막 에는 8℃에 저장하였다. 열대거세미나방을 제외한 다른 나방 류는 CO1 증폭용 범용 프라이머인 LCO1490 (5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3'), HCO2198 (5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3') (Folmer et al., 1994)을 위와 유사한 방법으로 98℃에서 10초 후 49℃에서 15 초, 68℃에서 30초로 30회 반복해서 PCR 반응시켰다.

PCR 증폭 후 증폭된 산물은 1% 아가로스 겔(핵산 염색: RedSafe^TM Nucleic Acid Staining Solution (20,000×), iNtRON biotechnology, Inc., Korea)에 로딩한 후 전기영동을 통해 확인 하였다. CO1 영역의 염기서열 해독을 위해 PCR 증폭 산물을 ㈜마크로젠 (Korea)에 의뢰해 Sanger sequencing를 수행하였 다. 시퀀싱 결과는 Chromas version 2.6.5 (Technelysium Pty Ltd., Australia)를 이용하여 크로마토그램을 재확인하고 양방 향의 시퀀싱 결과를 합쳐서 최종적으로 해당 샘플의 염기서열 을 확정하였다. 분자 동정을 위해서 미국국립생물정보센터 (NCBI) GenBank 데이터베이스와 BLAST 분석을 통해서 조 회한 염기서열(query)의 500 bp 이상에서 99% 이상의 유사도 (similarity)를 보이는 상위 첫번째의 종(species)을 탐색하였다. 마지막으로 BLAST 결과 확인된 종과 형태적 특징을 비교 한 후 트랩에 포획된 나방 성충의 종을 최종 동정하였다.

분자계통수 작성 및 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism) 분석

2019년 고창지역에서 7월부터 성페로몬 성분 2종류, Z9-14Ac와 Z7-12Ac를 100 : 2 비율로 제조한 미끼인 2C-300 과 2C-1000를 처리해 깔대기형과 델타형 성페로몬 트랩에 포 획된 열대거세미나방은 총 91마리였으나 PCR 증폭 및 시퀀싱 을 통해서 얻은 미토콘드리아 CO1 부분 영역 (1,004 bp)을 공 통적으로 갖는 70마리를 분자 계통수 분석에 활용하였다. 이 영 역은 열대거세미나방의 CO1 전체염기서열 1,531 bp 중에서 259번째 염기부터 1,262번째 염기 구간에 해당한다. 열대거세 미나방의 두 개의 종내 미토콘드리아 CO1 염기서열 변이군 (CO1-CS와 CO1-RS)으로 참고하기 위해 미국국립생물정보센 터(NCBI) GenBank 데이터베이스에서 1,004 bp의 공통 영역 을 갖는 총 17개의 CO1 염기서열을 선발하고 분석에 활용하였 다. 그리고 군외군(outgroup)으로는 동속종인 담배거세미나방 (S. litura)과 파밤나방(S. exigua)의 CO1 염기서열을 계통수 작 성에 사용하였다. 총 90개의 CO1 염기서열을 MEGA 7.0 (Kumar et al., 2015)에 탑재된 ClustalW 방법으로 배열 한 후에 Kimura 2-parameter 방법으로 유전적 거리(evolutionary distance) 를 계산하고 neighbor-joining 계통수를 추론하였으며 1,500회 반복(bootstrapping)으로 신뢰도를 검정 하였다.

한편, 열대거세미나방의 두 개의 종내 변이군(CO1-CS와 CO1-RS)의 CO1 전체 영역에서 변이군 별로 일관성 있게 단일 염기다형성(SNP)을 보이는 위치를 탐색하고자 일차적으로 미 국국립생물정보센터(NCBI) GenBank 데이터베이스의 총 9개 (MN385596.1, MN599980.1, MN599981.1, MN599982.1, MN599983.1, MN068212.1, NC_027836.1, MN803322.1, KU877172.1)의 CO1 전체 염기서열과 Gouin et al. (2017)이 열대거세미나방 전장 게놈 유전체 해독에 사용한 “기주식물계 통”(Corn-REF, 옥수수계통; Rice-REF, 벼계통)의 2개 CO1 전 체 염기서열, 총 11개를 MEGA 7.0 (Kumar et al., 2015)에 탑 재된 ClustalW 방법으로 배열 한 후에 염기서열 변이를 비교 분 석하였다. 이를 기준으로 분자계통수 분석에 사용하였던 나머 지 참조용 CO1 염기서열 8개(HQ177346.1, HQ177347.1, HQ 177348.1, HQ177349.1, HQ177350.1, HQ177351.1, HQ1773 52.1, HQ177353.1) (Kergoat et al., 2012)와 2019년 고창군에 서 성페로몬 트랩에 포획된 총 91마리 중에서 얻은 CO1 염기서 열 총 73개의 SNP 패턴을 같은 방법으로 비교 분석 후 정리하 였다.

데이터 정리 및 통계 분석

2019년 고창지역에서 열대거세미나방 성페로몬 트랩에 포 획된 나방류를 조사한 결과, 열대거세미나방 외에 뒷흰가는줄 무늬밤나방[Mythimna loreyi (Duponchel)]이 많이 포획되어 두 종에 대한 포획 시기와 마리수를 처리별로 함께 정리하였다. 먼저 트랩의 종류(깔때기형트랩 vs. 델타형트랩)와 성페로몬 미끼 함량(300 ㎍ vs. 1000 ㎍)에 따른 열대거세미나방과 뒷흰 가는줄무늬밤나방의 시기별 포획수와 조사 전기간 총 포획수 를 비교하였다. 각 처리의 시기별 포획수 변동은 앞뒤 조사일의 중앙일에 트랩당 포획수 평균값으로 표현하였다. 각 처리의 총 누적 포획수는 트랩당 총 포획수의 평균값으로 제시하였고 표 준오차값은 Jackknife resampling 방법으로 계산된 값을 제시 하였다. 각 처리별 열대거세미나방과 뒷흰가는줄무늬밤나방 의 총 포획수를 비교하기 위해서 R version 3.6.1 (The R Foundation for Statistical Computing, Austria) 프로그램을 이용하 여 일원분산분석(one-way ANOVA) 후 다중비교를 위해 Tukey’s HSD test (α = 0.05)를 실시하였다. 다음으로 날개형 트랩에 성페로몬 성분 조합이 다른 미끼(2C-1000W vs. 4C- 1000W)에 따른 두 종(열대거세미나방, 뒷흰가는줄무늬밤나 방)의 시기별 포획수와 조사 전기간 총 포획수를 비교하였다. 두 처리의 시기별 포획수 변동은 앞뒤 조사일의 중앙일에 트랩 당 포획수 평균값으로 표현하였다. 두 처리의 조사 전기간 총 누적 포획수는 트랩당 총 포획수의 평균값으로 제시하였고 표 준오차값은 Jackknife resampling 방법으로 계산된 값을 제시 하였다. 두 처리간 평균값의 차이는 t-test (α = 0.05)를 통해서 유의성을 확인하였다.

결과 및 고찰

열대거세미나방 성페로몬 트랩의 나방류 포획 효과

2019년 07월 초부터 11월 말까지 우리나라 서남해안 지역인 고창군의 옥수수 밭 주변에서 성페로몬을 이용하여 열대거세 미나방(S. frugiperda) 성충을 효과적으로 모니터링하는 방법 을 조사하였다. 트랩을 설치한 곳은 같은 해 06월 21일과 24일 에 3-5령기의 열대거세미나방 유충이 발견된 동일한 옥수수 포 장의 주변이었다(Lee et al., 2020). 총 함량이 300 ㎍ 또는 1000 ㎍인 2종류 성분 조성의 성페로몬 미끼[(100%) Z9-14Ac, (2%) Z7-12Ac]를 설치한 깔대기형트랩과 델타형트랩에서 열대거 세미나방의 트랩당 포획수를 비교한 결과 유의한 차이가 있었 다(F_{(3, 16)} = 29.54, P < 0.001). 두 성분 조성의 총 300 ㎍ 미끼를 설치한 깔대기형트랩(2C-300-F)에서 08월 06일에 처음 잡히 기 시작해 11월 02일까지 포획되었고(Fig. 1B), 트랩당 누적포 획수도 10.0 ± 1.28 (mean ± S.E.) 마리로 1000 ㎍ 미끼의 깔대 기형트랩(2C-1000-F)의 트랩당 누적포획수인 5.6 ± 0.79 마리 보다 약 1.8배 많았다(Fig. 2A). 델타형트랩에서는 총 함량 300 ㎍ (2C-300-D)과 1000 ㎍ (2C-1000-D) 모두 트랩당 누적포획 수가 각각 1.8 ± 0.20 마리와 0.8 ± 0.20 마리로 낮았다(Fig. 2A). 이는 2017년 아프리카 토고(Togo)에서 세 종류의 성페로몬 조 성 미끼들[(2C) 90.5% Z9-14Ac, 9.5% Z7-12Ac; (3C) 66.1% Z9-14Ac, 4.7% Z11-16Ac, 29.3% Z7-12Ac; (4C) 78.3% Z9-14Ac, 3.6% Z11-16Ac, 11.2% Z7-12Ac, 7.0% Z9-12Ac] 모두가 델타형트랩보다는 깔대기형트랩에 설치했을 때 열대거 세미나방의 포획수가 더 많았던 결과와 크게 다르지 않았다 (Meagher Jr et al., 2019).

본 연구에서 열대거세미나방은 깔대기형트랩에 설치한 2성 분 조성의 성페로몬 미끼[(100%) Z9-14Ac, (2%) Z7-12Ac]의 총 함량 1000 ㎍ (= 1.00 mg) 보다는 더 적은 300 ㎍ (= 0.30 mg)에서 포획 효과가 더 좋았다(Fig. 2A). 그러나 Tumlinson et al. (1986)은 깔대기형트랩에 2성분 조성[(96.6%) Z9-14Ac, (3.4%) Z7-12Ac]의 총 함량이 각각 0.06 mg, 0.20 mg, 2.00 mg 인 미끼를 미국 플로리다주의 수수(sorghum) 밭에 설치했을 때 2.00 mg에서 포획수가 가장 많았으며 다음으로는 0.20 mg으로 그 차이는 3배 이상 수준이었다. Batista-Pereira et al. (2006)의 연구 결과에서도 날개형트랩에 2성분 조성[(100%) Z9-14Ac, (1%) Z7-12Ac]의 총 함량이 각각 10.00 mg, 1.00 mg, 0.10 mg 과 처녀암컷을 미끼로 하여 브라질 Minas Gerais 주의 옥수수 밭에 설치했을 때 1.00 mg에서 포획수가 가장 많았고 다음으로 는 10.00 mg, 처녀암컷, 0.10 mg 순이었다. 다른 나방류에서 성 페로몬 미끼의 함량에 따른 포획수 비교 결과를 보면, 북미에서 사과원의 해충인 밤나방과의 Lacanobia subjuncta은 세 개의 성페로몬 성분 조합(Z11-16Ac, Z11-16Ald, Z11-16Alc)의 함 량을 0.00 mg, 0.06 mg, 0.20 mg, 0.70 mg, 2.00 mg, 6.10 mg으 로 증가시킴에 따라서 포획되는 수도 증가하는 양의 상관관계 (r² = 0.81)를 보였다(Landolt and Smithhisler, 1998). 본 연구에 서도 Tumlinson et al. (1986)과 Batista-Pereira et al. (2006)의 연구 결과처럼 고무격막(rubber septum)에 침투시킨 1.00 mg 미끼가 0.30 mg 미끼보다 더 포획 효과가 있을 것으로 예상하 였으나 반대의 결과를 얻었다(Fig. 2A). 앞으로 열대거세미나 방의 발생 밀도가 다른(높거나 낮은) 국내 야외포장에서 다양 한 범위의 함량에 대한 추가적인 검토가 필요해 보인다.

한편, 본 연구의 깔대기형트랩 모두(2C-300-F, 2C-1000-F) 에서 비표적종(non-target species)인 뒷흰가는줄무늬밤나방이 09월 21일과 11월 21일경에 집중적으로 포획되었으며(Fig. 1C) 델타형트랩에서는 거의 포획되지 않아 열대거세미나방과 유사하게 트랩 종류에 따라서 차이를 보였다(F_{(3, 16)} = 79.97, P < 0.001). 뒷흰가는줄무늬밤나방은 벼와 밀, 보리, 사탕수수, 옥 수수 등에 해충이며 아프리카와 호주, 극동 및 중동 아시아 지 역에 분포한다(Qin et al., 2017). 아프리카 토고에서 Meagher Jr et al. (2019)이 조사한 결과를 보면 뒷흰가는줄무늬밤나방의 경우 트랩의 종류 보다는 성분 조합에 따라서 포획수에 차이가 있었는데 열대거세미나방의 3성분 성페로몬 조합(3C)에서 가 장 많이 포획되었다. 그러나 비표적종들 전체의 포획수는 성분 조합보다는 트랩의 종류에 따라서 차이를 보였는데 델타형트 랩에서 가장 많았다. 열대거세미나방의 성페로몬 트랩에 뒷흰 가는줄무늬밤나방이 많이 포획된 것은 두 종(species)의 성페 로몬 성분인 Z7-12Ac, Z9-14Ac, Z11-16Ac를 서로 공통적으 로 공유하고 있기 때문으로 보인다(Takahashi et al., 1979;Sato et al., 1980;Ho et al., 2002). 미국 펜실베니아주에서 열대거세 미나방의 성페로몬 성분 조합에 따른 나방 포획 효과를 조사한 결과를 보면, 3성분 조합(Z9-14Ac, Z11-16Ac, Z7-12Ac)과 4 성분 조합(Z9-14Ac, Z11-16Ac, Z7-12Ac, Z9-12Ac)에서 열대 거세미나방과 비표적종인 Leucania phragmatidicola를 가장 많이 포획하였으며 이를 통해 Z9-14Ac와 Z11-16Ac가 관련이 있음이 추정되었다(Fleischer et al., 2005). 특히, 미국 북동지역 에서는 2성분 조합(Z9-14Ac, Z7-12Ac)에서 열대거세미나방 포획수가 비교적 적었지만 동시에 비표적종인 L. phragmatidicola가 가장 적게 포획되어 이를 통해 2성분 조합이 열대거세 미나방을 모니터링하는데 유용할 것으로 제안하였다(Fleischer et al., 2005). 본 연구의 깔대기형트랩 (2C-300-F, 4C-1000-F) 에서는 추가로 비표적종으로 밤나방과(Noctuidae)에 속하는 6 종[파밤나방(S. exigua), 썩은밤나방(Axylia putris), 독일검은 밤나방(Discestra trifolii), 점박이밤나방(Hermonassa cecilia), 목화잎밤나방(Anomis flava), 뒷날개흰밤나방(Aedia leucomelas)] 과 포충나방(Crambidae)과에 속하는 1종[콩잎말이명나방 (Pleuroptya ruralis)]도 한두 마리씩 포획되었으며 이들은 해 독된 CO1 영역 부분 염기서열의 NCBI BLAST 결과 99% 이상 의 유사도(similarity)를 갖는 종으로부터 추정되었다(Supplement Table 2). 또한 뒷흰가는줄무늬밤나방 수컷 성충을 비롯 해 이들은 모두 열대거세미나방의 성충과 날개 무늬 등 형태적 으로 쉽게 구별이 가능하였다(Fig. 1A, Seo, B. Y., personal observation). 하지만 아프리카 토고에서는 성페로몬 트랩에 비 표적종으로 뒷흰가는줄무늬밤나방 외에 23 종의 나방이 포획 되었는데 그 중에는 열대거세미나방과 형태적으로 유사한 S. triturata가 포함되어 있어(Meagher Jr et al., 2019), 조사 지역 에 따라서 열대거세미나방의 포획 효과 및 비표적종의 종류와 이를 고려한 지역별 적합한 트랩형과 성분 조성(조합) 탐색이 필요해 보인다. 국내에서도 열대거세미나방 성페로몬 트랩을 이용한 성충 발생 모니터링 기술 개발을 위해 열대거세미나방 의 포획 효과를 증가시키는 동시에 비표적종으로 가장 많은 수 가 포획되고 있는 뒷흰가는줄무늬밤나방의 포획을 억제시킬 수 있는 방법에 대한 고려가 필요해 보인다.

총 함량이 1000 ㎍인 2종류 성분 조성[(100%) Z9-14Ac, (2%) Z7-12Ac] (2C-1000-W)과 4종류 성분 조성[(100%) Z9-14Ac, (8%) Z11-16Ac, (2%) Z7-12Ac, (1%) Z9-12Ac] (4C-1000-W)의 미끼를 설치한 날개형트랩에서 열대거세미나 방은 08월 26일부터 포획되기 시작하였으며 11월 02일까지 평 균 1.0 마리/트랩/주(week) 이하의 낮은 포획수를 보였다(Fig. 3A). 총 포획된 열대거세미나방의 성충 수도 두 미끼 간 유의한 차이를 보이지 않았다(by t-test, t = -0.89, P = 0.422) (Fig. 4A). 뒷흰가는줄무늬밤나방도 두 미끼 모두에서 포획되었는데 특 히, 4종류 성분 미끼(4C-1000-W)에서는 08월 18일에 한 번 포 획된 후 09월 14일부터 11월 10일까지 지속해서 포획되었으며 09월 21일에는 최곳값(평균 11.3 마리/트랩/주)을 보였다(Fig. 3B). 총 포획된 뒷흰가는줄무늬밤나방 성충의 수는 2종류 성분 미끼(2C-1000-W) 보다는 4종류 성분 미끼(4C-1000-W)에서 5 배 이상 많이 포획되는 차이를 보였다(by t-test, t = 4.83, P = 0.008). 이는 앞서 언급한 바와 같이 열대거세미나방의 Z7-12Ac, Z9-14Ac, Z11-16Ac와 뒷흰가는줄무늬밤나방의 성페로몬 성 분이 공통적으로 활용되기 때문으로 추정된다(Takahashi et al., 1979;Sato et al., 1980;Ho et al., 2002). 그리고 아프리카 토고에서 조사한 Meagher Jr et al. (2019)에서는 2종류 성분 미 끼(2C)와 4종류 성분 미끼(4C)의 뒷흰가는줄무늬밤나방 포획 수는 다르지 않았으나 3종류 성분 미끼(3C)에서 뒷흰가는줄무 늬밤나방 포획수가 가장 많아 본 연구의 결과(Fig. 4B)와 차이 를 보여 지역별로 다른 양상이 관찰되었다.

본 연구의 성페로몬 트랩에 포획된 결과를 종합하여 정리하 면, 2019년 고창지역에서 발생한 열대거세미나방은 총 함량 300 ㎍인 2가지 성분 조합의 성페로몬 미끼[(100%) Z9-14Ac, (2%) Z7-12Ac]를 깔대기형트랩(funnel-type bucket trap)에 설 치했을 때 포획수가 가장 많았다(Fig. 2A). 그러나 비표적종으 로 밤나방과 7종과 포충나방과 1종이 포획되었으며(Supplement Table 2) 그 중에서 08월 하순이후부터 줄무늬밤나방아과 (Hadeninae)의 뒷흰가는줄무늬밤나방이 함께 다수 포획(Fig. 1C)될 수 있어 열대거세미나방과 구별이 필요하였다. 이상의 결과로 보아 2019년 06월에 열대거세미나방 유충이 처음으로 발견되기 전에 이미 제주도를 비롯한 남부지방에 성페로몬 트 랩[깔대기형트랩 + 미끼(300 ㎍ 성페로몬, 100% Z9-14Ac와 2% Z7-12Ac)]을 설치하였지만 초기 비래 성충의 발생이 확인 되지 않았던 것은 설치된 미끼와 트랩의 낮은 포획 효과 보다는 2019년 열대거세미나방의 적은 비래량과 설치한 트랩 수와 설 치 지점 수가 작아 역동적인 기류의 흐름에 따라 비래 후 나방 이 떨어지는 낙하지점이 유인될 수 있는 범위 안에 들어오지 않 았던 원인이 더 컸기 때문으로 추론되었다. 열대거세미나방의 초기 비래 예찰을 위해서는 옥수수, 수수, 화본과 목초지 등 선 호기주식물 주변과 여러 지역 및 지점에 트랩을 설치해야 할 것 으로 보인다.

앞으로 국내 환경에 적합한 열대거세미나방 예찰법 개발을 위해 국내에서 열대거세미나방의 포획 효과와 비표적 나방류 에 대한 다양한 성페로몬 성분 조합과 함량의 영향 평가를 위한 추가적인 야외 조사가 필요해 보인다. 열대거세미나방 성충의 발생 소장 결과는 열대거세미나방의 알기생벌 등 국내 토착 천 적류 탐색 및 생물적/화학적 방제 기술 적용을 위한 유용한 정 보가 될 것으로 기대된다.

성페로몬 트랩에 포획된 열대거세미나방의 분자계통수 및 단일염기다형성 분석

2019년 07월 초부터 11월 말까지 고창군의 옥수수 밭 주변 에서 성페로몬 트랩을 이용하여 총 91마리의 열대거세미나방 수컷 성충을 포획하였다. 그중 70마리의 CO1 부분 영역(1,004 bp)을 확보해 NCBI GenBank에 등록된 공통 영역을 갖는 17개 의 열대거세미나방과 염기서열을 배열하고 neighbor-joining tree를 추론한 결과(Fig. 5), 열대거세미나방의 CO1 부분 영역 을 이용한 분자계통수 분석 결과(Kergoat et al. 2012;Otim et al., 2018;Lee et al., 2020)와 마찬가지로 Spodoptera속인 담배 거세미나방(S. litura) 및 파밤나방(S. exigua)과 독립적으로 구 분되었으며 크게 두 개의 종내 그룹[CO1-RS and CO1-CS in this study; S. frugiperda ‘rice’ and S. frugiperda ‘corn’ in Kergoat et al. (2012) and Otim et al. (2018); Clade (A) and Clade (B) in Lee et al. (2020)]으로 나뉘었다. 고창에서 채집된 66마리의 열대거세미나방은 CO1-RS 그룹에 속했고 4마리만 CO1-CS 그룹에 속했다(Fig. 5). CO1-RS 그룹의 66마리와 CO1-CS 그룹의 4마리는 각각 그룹별 단일한 haplotype으로 분 류되어 2019년 고창에서 총 2개의 haplotype 발생이 확인되었 다. 고창에서 포획된 CO1-RS 그룹은 2019년 6월에 제주, 전남 무안, 경남 밀양의 옥수수 포장에서 채집된 열대거세미나방과 동일한 haplotype이었다(Fig. 5). 또한 2019년 중국 윈난성 (Yunan, China)에서 채집된 열대거세미나방과도 같았으며 채 집 시기와 지역은 다르지만 아프리카 대륙의 나이지리아(Nigeria) 및 남미의 프랑스령 기아나(French Guiana)에서 채집된 열대 거세미나방과도 동일한 haplotype이었다(Fig. 5). Lee et al. (2020)은 2019년 6-7월에 제주, 전남(보성, 영암, 무안, 해남, 여 수, 강진), 전북(고창), 경남(밀양)의 옥수수 포장에서 채집한 총 31마리의 열대거세미나방 ‘유충’의 CO1 영역에 대한 haplotype 분석에서도 총 2개의 haplotype (hap-1 in Clade A and hap-2 in Clade B)이 확인되었고 그 중에 29개가 hap-1으로 대부분이었다고 보고하였다. Lee et al. (2020)의 haplotype 분 석 결과는 비록 본 연구에서 분석한 CO1 영역과 일부만 겹치고 완전히 같지 않았지만 2019년 07월부터 11월까지 고창의 한 지 역에서 발생한 열대거세미나방 ‘성충’을 대상으로 CO1 영역을 조사한 본 연구의 결과와 다르지 않았다.

열대거세미나방의 미토콘드리아 CO1 전체 영역(1,531 bp) 에서 두 개의 종내 그룹(CO1-RS vs. CO1-CS)과 기주식물계통 (벼계통 vs. 옥수수계통)에서 총 12개의 일관성 있는 단일염기 다형성(SNP)이 2개 구간에서 확인되었는데 기존에 알려진 CO1B [(벼계통의 nucleotide) / (옥수수계통의 nucleotide) _CO1 position : C/T₁₁₂₅, C/T₁₁₇₆, T/C₁₁₈₂, and A/T₁₂₁₆)] 4개(Nagoshi et al., 2018)와 본 연구에서 새롭게 탐색된 CO1X (A/T663, C/T759, T/C768, A/G798, T/C816, T/C823, T/A912, and C/T987) 8개이다 (Table 1). 이중에서 단백질 번역(translation)시 아미노산이 바 뀌는 A/T₁₂₁₆ (synonymous SNP)을 제외하고 모두 단백질 번역 시 아미노산 변이가 없는 nonsynonymous SNP였다. 열대거세 미나방의 미토콘드리아 CO1 전체 영역으로부터 총 510개의 아미노산으로 구성된 단백질이 예측되는데 두 개의 종내 기주 식물계통은 여러 개의 다양한 SNP가 있지만 단백질 번역시 앞 서 언급한 SNP A/T₁₂₁₆에 의한 벼계통의 Met₄₀₆과 옥수수계통 의 Leu₄₀₆을 제외하고 모두 동일한 아미노산 서열이 예측된다 (Seo, B. Y., unpublished observation). 총 12개의 일관성 있는 단일염기다형성(SNP) 분포 패턴을 분석한 결과, 2019년 고창 에서 성페로몬 트랩에 포획된 73마리의 열대거세미나방 수컷 성충 중에 69마리는 CO1-RS 그룹과 벼계통에서 보이는 동일 한 SNP 패턴을 보였으며 나머지 4마리는 CO1-CS 그룹과 옥수 수계통에서 보이는 동일한 SNP 패턴을 보였다(Table 1). Nagoshi et al. (2018, 2019)은 열대거세미나방 발생이 아프리 카 대륙에서 처음으로 확인된 2016년부터 2017년 사이 채집된 사하라 사막 이남(sub-Saharan Africa)의 아프리카 샘플들(Togo and other countries of Africa)과 원산지인 서반구 지역(Western Hemisphere)의 북미(Texas and Florida, USA)와 중·남미 (Brazil, Argentina, Bolivia, Peru, Puerto Rico, and Dominican Republic) 샘플들의 CO1-CS 그룹에서 보이는 CO1 SNP R (A or G)₁₁₆₄와 R (A or G)₁₂₈₇의 SNP 패턴 분포를 비교한 결과, 특 히, 서아프리카의 Togo와 São Tomé and Príncipe은 다른 아프 리카 샘플보다 높은 비율의 G₁₁₆₄ G₁₂₈₇를 보여 Florida- Caribbean 샘플의 CO1-CS 그룹 우점 패턴과 유사하였지만 A₁₁₆₄ G₁₂₈₇가 우점인 Texas-South America 패턴과 달랐다고 보고하였다. 이를 통해서 2016-2017년 서아프리카에서 발견 초기에 발생한 옥수수계통이 Florida-Caribbean 기원으로 제안 되었다. 본 연구의 2019년 고창군에서 포획된 CO1-CS 그룹의 4개 샘플 모두 G₁₁₆₄ G₁₂₈₇로 확인되었으며(Table 1) 이는 서아 프리카와 Florida-Caribbean 지역에서 우점하는 옥수수계통과 같았다. 같은 방법으로 2017년 아프리카 Togo에서 성페로몬 트랩에 포획된 CO1-CS 그룹에 속하는 수컷 ‘성충’ 163마리를 분석한 결과에서도 G₁₁₆₄ G₁₂₈₇ SNP가 97.5%로 우점하였고 나 머지 2.5%는 A₁₁₆₄ G₁₂₈₇ SNP였으며 2016년 같은 지역의 옥수 수에서 채집된 ‘유충’의 패턴과 매우 유사하였다(Meagher Jr et al., 2019). 본 연구에서 CO1-CS 그룹에 속하는 4마리로는 SNP 분포 패턴의 우점도를 추정하기 어려우나, 2019년 고창에서 포 획된 열대거세미나방은 아프리카 토고와 Florida-Caribbean 지 역에서 우점하는 옥수수계통과 모두 같은 SNP 분포 패턴을 갖 고 있어 원산지 및 이동경로를 추정하는데 하나의 단서가 될 수 있을 것으로 보인다. 열대거세미나방이 원산지가 아닌 서아프 리카에서 발생이 처음 확인되고 계속 확산해 서아시아에서 동 아시아 지역으로 순차적으로 발생한 기록(Goergen et al., 2016;Nagoshi et al., 2018;Li et al., 2019;Lee et al., 2020)이 있고 열 대거세미나방이 발생한 첫해 및 매년 우리나라를 비롯한 인도, 중국 등 아시아의 다른 지역별 SNP 분포 패턴 정보를 얻는다면 북미에서 수행한 열대거세미나방의 이동경로 추정 사례 (Nagoshi et al., 2012)와 같이 앞으로 비래원 및 이동경로를 추 적하는데 간접적인 증거로 활용할 수 있을 것이다.

열대거세미나방은 중국 남부와 그 인접 국가인 미얀마로부 터 2가지 이동경로를 통해 해마다 기류를 타고 비래할 것으로 추정되며(Li et al., 2019) 우리나라의 농작물 재배 포장에 매년 발생할 가능성이 높아졌다. 따라서 해마다 성페로몬 트랩 등을 이용해 국내에서 발생하는 열대거세미나방을 예찰하고 SNP 분석 등 유전 분석을 통해 기주식물계통 확인 및 비래원 추적 등이 필요할 것으로 보이며, 본 연구에서 수행하고 얻은 성페로 몬 트랩의 포획 효과와 CO1 SNP 연구 결과들은 앞으로 이를 수행하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.