배추(Brassica campestris var. pekinensis)는 김치의 주원료 로 우리나라에서 중요한 작물이다(Kim et al., 2014). 배추는 재 배의 연중생산 체계가 확립되어 4계절 수확이 가능하지만, 해 발 400~1,000 m의 강원도 고랭지 권역은 년도별로 차이가 있 지만 우리나라에서 출하되는 여름배추의 90% 내외가 재배되 고 있다(KOSIS, 2018).

배추에는 다양한 병해충들이 피해를 주고 있는데(Seo et al., 2009) 강원도 태백시의 고랭지 배추 재배지에서 관리병해충으 로 지정된 사탕무씨스트선충(Heterodera schachtii)에 의한 피 해가 2011년 최초로 확인되었으며(Park et al., 2011) 삼척시와 정선군의 일부 고랭지배추 재배지에서 배추에는 피해를 일으 키지 않는 콩씨스트선충(H. glycines)도 검출되어 방제 의사결 정에 정확한 종 동정의 필요성이 제기 되었다(Ko et al., 2017). 아울러 이들 고랭지 배추재배지에서는 이들 두 씨스트선충 이 외에도 클로버씨스트선충(H. trifolii)도 혼재하여 발생하는 것 으로 확인되었다(Okki et al., 2018).

사탕무씨스트선충은 사탕무(Beta bulgaris) 재배지에서 수 량손실을 유발하는 주요 선충으로 명아주과, 십자화과, 마디풀 과, 콩과 등 23과 95속 200종 이상의 식물을 기주로 하는데 전 세계적으로 61개국에 분포한다(Steele, 1965;Subbotin et al., 2010). 우리나라에서도 17과 276품종의 식물에 대한 사탕무씨 스트선충의 저항성 검정을 통해 감수성 106품종, 중감수성 40 품종을 밝힌 바 있다(Kim et al., 2016).

클로버씨스트선충도 유럽, 아프리카, 아메리카 등 세계 전역 의 44개국에 분포하며 비름과, 배추과(겨자과), 명아주과, 콩과, 꿀풀과, 마디풀과 등 110종 이상의 폭넓은 기주범위를 가지고 있다(Evans et al., 1998;Subbotin et al., 2010).

콩씨스트선충은 콩과 작물에 주로 피해를 일으키지만 22과 63종의 비 콩과 작물이나 9과 66종 이상의 잡초에도 기생을 한 다(Subbotin et al., 2010). 우리나라를 비롯하여 중국, 일본, 미 국, 브라질, 아르헨티나 등 전 세계 콩 주산지에서 발생이 확인 되고 있으며 콩에 발생하는 병해충 중에서 가장 중요하게 취급 된다(Donald et al., 2006;Subbotin et al., 2010).

Heterodera속 선충은 유전적으로 매우 근연관계의 종으로 형태적으로 매우 유사하다(Starr et al., 2002;Subbotin et al., 2010). 따라서 형태적 특징에 의한 구분에는 고도의 전문성이 필요하여 최근에는 신속하고 정확한 종 동정을 위하여 PCRRFLP, SCAR-PCR 등 분자진단기술에 의한 동정법이 개발되 고 있다(Cui et al., 2017).

종 특이 프라이머(Species specific primer)를 이용하면 특정 종의 선충을 신속하게 동정할 수 있는데 Heterodera 속 씨스트 선충에 대한 종 특이 프라이머는 Amiri et al. (2002)에 의해 ITS rRNA 영역을 대상으로 연구되기 시작하였고, 최근에는 18S ribosomal RNA, Actin 1과 mitochondrial DNA의 COI 등 다 양한 유전자 영역이 종 특이 프라이머 연구에 이용되고 있다 (Toumi et al., 2013a, 2013b). 이러한 유전자영역의 염기서열 비교로 종 구분이 어려웠던 Heterodera 속 ‘Schachtii’ group에 포함되는 사탕무씨스트선충과 콩씨스트선충, 클로버씨스트선 충, H. daverti, H. ciceri의 종 동정을 간단하게 할 수 있게 되었 다(Vovlas et al., 2015). 그러나 우리나라에서는 2011년 강원도 태백의 고랭지 배추 재배지에서 발견 된 씨스트선충이 사탕무 씨스트선충으로 동정 된 이후 분류학적 고찰 없이 매년 씨스트 선충 감염 조사를 수행해 오고 있다. 따라서 본 연구는 2011년 고랭지 배추 재배지에서 발생이 확인 된 씨스트선충의 확산에 대한 정보 취득과 혼재가 확인 된 3종의 씨스트선충(Ko et al., 2017;Okki et al., 2018) 발생 정도를 알아보기 위하여 수행하 였는데 2016년까지는 씨스트선충의 종을 고려하지 않고 감염 포장에 대한 조사를 수행하였으며 2017년에는 3종의 씨스트 선충 종 구분이 가능한 종 특이 프라이머를 이용한 Real-time PCR기법으로 우리나라의 고랭지 여름배추 주산지역인 강원 도 배추포장에 대한 씨스트선충의 분포를 조사하였다.

재료 및 방법

고랭지 배추 재배포장 토양채취

2014년부터 2017년까지 국내 여름배추 최대 주산지인 강원 도 내 5개 시군(삼척시, 정선군, 태백시, 영월군 및 강릉시)의 배 추포장을 대상으로 토양 시료를 채취하였다. 조사 포장은 전년 도 발생지 인근을 중심으로 선정하였는데 여름배추의 생육 시 기인 6월부터 8월 사이에 전년도 발생 포장 주변을 중심으로 토 양 시료를 채취하였다. 토양채취는 배추 생육 중·후기에 포장 당 10지점에서 배추 포기 주변 5~20 cm 깊이 토양을 지점 당 약 200 g씩 모종삽을 이용하여 채취하여 포장 당 2 kg의 토양을 비 닐팩에 담아 실험실로 이송하여 8℃ 냉장고에 보관하면서 씨 스트선충을 조사하였다.

포장별 씨스트 분리 및 밀도 조사

선충 씨스트의 분리는 각 토양 시료별로 비닐팩 내에서 골고 루 섞은 다음 10 L 비이커에 300 cm³ 토양을 정량하여 담은 후 6~8 L의 수돗물을 채워서 현탁액을 만든 뒤 이 현탁액을 20 mesh 및 60 mesh체로 차례로 거른 다음, 60 mesh체에 걸러진 씨스트를 회수하여 입체현미경(LEICA-MZ75, Germany)에서 씨스트 밀도를 조사하였다. 또한 20 mesh 체에 걸러진 유충의 밀도도 해부현미경 하에서 수행하였다. 씨스트 내의 알 조사는 각 시료별로 3개의 건전한 씨스트를 현미경하에서 임의로 선정 한 뒤 표면이 오목한 미생물 계수용 슬라이드글라스 위에 놓고, 끝이 뾰족한 멸균 유리봉으로 씨스트를 터트리고, 증류수 1 ml 로 희석한 후 나출된 알 수를 현미경 하에서 조사하였다.

선충 씨스트로부터 total DNA추출

선충의 게놈DNA의 추출은 AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer Corporation)를 이용하였다. 각 토양시 료에서 분리한 알이 차 있는 건전한 갈색 씨스트 3개씩을 1.5 ml 마이크로튜브에 담아 잘 마쇄하고, 200 μl의 Tissue lysis buffer, 20 μl proteinase K를 첨가하여 60℃에서 3시간 동안 용해반응 을 시켰다. 이어서 200 μl의 Binding buffer를 첨가하여 강하게 교반하였다. 이 반응액에 100 μl의 Isopropanol을 첨가하고, 피 펫팅으로 고르게 혼합한 용액을 Binding column tube에 넣어 8,000 rpm, 1분간 원심분리를 2회 반복하여 DNA를 column에 흡착시켰다. 이어서 Ethanol을 첨가한 500 μl의 Washing buffer 로 column을 원심분리하여 세척하였다. 이어서 column을 새 1.5 ml 마이크로튜브에 옮기고, 200 μl의 Elution buffer를 첨가 하여 실온에서 1분간 반응 시킨 후, 8,000 rpm에서 1분간 원심 분리하여 선충의 정제 DNA를 회수하였다. DNA는 4℃ 또는 장기간 이용시에는 -20℃에 보관하였다.

Real-time PCR을 이용한 Heterodera 속(genus) 선충의 종(species) 분석

씨스트선충의 종 분석은 Species Specific Real-Time PCR Nematode diagnostic kits (ClearDetections. The Netherlands) 로서 3종 선충(클로버씨스트선충 = RT-N-D-1202, 사탕무씨스 트선충 = RT-N-D-1205, 콩씨스트선충 = RT-N-D-1204) 진단키 트가 이용되었다. 분석에 이용된 PCR 프라이머는 Heterodera 속(genus)으로 분류되는 사탕무씨스트선충, 클로버씨스트선 충 및 콩씨스트선충에 대하여 종 판별이 가능하도록 디자인 된 종 특이 프라이머(species specific primers)이다. Real-time PCR 기기는 Exicycler™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (Bioneer Corporation)을 사용하였으며, RT-PCR 분석을 위한 반응물의 조성은 SYBR Green ClearDetections PCR Mixture 15 ul에 각 토양시료의 씨스트에서 추출, 정제한 선충DNA를 멸균증류수로 10배 희석한 DNA용액 5 ul를 추가하여 총 20 ul 용액을 RT-PCR반응에 이용하였다. Real-time PCR의 반응은 enzyme activation (3 min, 95℃) → amplication (10 sec, 95℃ -60 sec, 63℃-30 sec, 72℃) 35 cycles, melt curve (0.2~0.5℃ steps, 72~95℃)로 하였다. Real-Time PCR의 결과는 Exicycler™ 96 (Ver.4) 분석 프로그램을 이용하여 Ct값과 melting curve를 분 석하였으며, 선충 종 동정에 필요한 대조 DNA (Positive control) 는 Clear Detections사에서 제공된 3종을 사용하였다. NAC (Negative amplification control)의 Ct값이 산출되지 않았으며, PAC (Positive amplification control)의 Ct값이 25 이하, template DNA의 Ct값이 35 이하일 때를 해당 종에 대한 Pass로 간주하 였다.

결 과

고랭지 배추 재배지 토양 내 씨스트선충 감염 포장 수 및 발생면적

고랭지 배추 재배지역에서 씨스트선충 감염 포장은 매년 확 산 되어 2017년까지 정선지역이 245개소로 가장 많았으며 강 릉지역은 2017년 조사에서 1곳의 신규 감염 포장이 확인 되었 다(Table 1). 씨스트선충이 검출 된 배추 포장 면적은 매년 증가 하였는데 2013년에는 39.6 ha가 추가 되었으며, 2017에는 31.8 ha가 추가되었다(Table 1).

지역별 씨스트선충 종류별 발생분포 및 포장별 씨스트 및 알 밀도조사

2017년 강원도 5개 시군 116개소 고랭지 여름배추 재배 포 장에서 작물생육기 토양 내 씨스트선충의 발생상황을 조사한 결과 씨스트선충이 발생한 포장 수는 전체의 36.2%인 42개소 였다(Table 2). 지역별로 씨스트선충이 검출 된 포장의 비율은 차이를 보여 삼척지역이 65.7%로 가장 높았고, 강릉지역은 10% 의 검출율을 보였다(Table 2). 토양 300 cc당 씨스트와 알 수는 포장별로 편차가 심하였으나 지역별 평균 수는 씨스트선충이 검출 된 포장의 비율이 가장 높았던 삼척지역에서 가장 많았고, 검출율이 가장 낮았던 강릉지역이 가장 적었다(Table 2).

Real-time PCR을 이용한 Heterodera 속 선충의 종별 분포 분석

Table 2에서 조사 된 씨스트선충 발생포장 42곳 중에서 선충 의 DNA가 확보된 38개 시료에 대하여 Real-time PCR을 이용 하여 씨스트선충의 종을 구별할 수 있었다. 사탕무씨스트선충 은 4개소, 클로버씨스트선충은 25개소, 콩씨스트선충은 12개 소 포장에서 확인 되었으며 2개의 선충 종(사탕무 + 클로버씨스 트선충 또는 콩 + 클로버씨스트선충)이 혼재하고 있는 배추포 장도 각각 1개소와 2개소로 조사되었다(Table 3, Fig. 1).

사탕무씨스트선충의 발생포장은 정선지역 세 곳과 삼척지역 한 곳으로 씨스트선충 감염포장의 3.4%였으며(Table 3, Fig. 1) 발생면적은 0.76 ha이었다. 이들 포장의 토양 300 cc당 씨스트 밀도는 최저 33개부터 최고 400개 이상으로 발생한 모든 포장 에서 고밀도의 씨스트가 존재하였으며, 이들 포장의 배추생육 은 정상주에 비하여 매우 위축되고 결구불량 등 비상품율이 전 체포장의 40~50%로 조사되었다(Observation data).

클로버씨스트선충은 영월지역을 제외한 4개 시군, 25개 포장 에서 확인되어 전체 조사포장의 21.6%를 차지하여 고랭지 재 배지에서 확인 된 선충들 중 발생빈도가 가장 높았다(Table 3). 발생면적은 2.42 ha이었으며 이들 발생포장의 토양 300 cc당 씨스트 밀도 60개 이상의 포장은 18개소(발생포장 72%)로 이 들 포장의 배추생육은 사탕무씨스트선충 발생포장과 동일하게 정상주에 비하여 매우 위축되고 결구불량 등 비상품율이 전체 포장의 30~40%였다(Observation data).

콩씨스트선충은 강릉지역을 제외한 4개 시군, 12개 포장에 서 검출되어 전체 조사포장의 10.3%를 차지하였다(Table 3). 발생면적은 0.92 ha이었으며, 이들 발생포장의 토양 300 cc당 씨스트 밀도 30개 이상의 포장은 6개소(발생포장 50%)로 이들 포장 중에서 태백시 통동 2개소의 포장은 클로버씨스트선충과 복합감염포장이었다(Fig. 1). 콩씨스트선충만 감염된 포장의 배 추생육은 비감염주와 생육 차이를 보이지 않았다(Observation data).

고 찰

우리나라에 분포하는 Heterodera속 씨스트선충류는 7종인 데(Lee et al., 2018) 이들 중 경제적 피해가 심한 선충은 콩씨스 트선충과 사탕무씨스트선충, 클로버씨스트선충이다(Mass and Heijbroek, 1982;Müller, 1999;Wrather et al., 2001). 특히 우 리나라에서 관리병해충으로 지정되어 있는 사탕무씨스트선충 과 클로버씨스트선충은 우리나라 고랭지 재배지에서 주로 재 배되고 있는 배추와 양배추와 같은 십자화과 작물의 생육저하 와 수량손실, 상품성 저하를 유발한다(Ko et al., 2017;Lee et al., 2018). 따라서 고랭지 배추 재배지에서 이들 씨스트선충류 의 발생은 수량손실 및 상품성 저하 등으로 인해 경제적 손실이 크기 때문에 씨스트선충 발생지에서는 씨스트선충의 유인 녹 비작물로 알려진 화이트머스타드를 파종하여 밀도를 줄이는 방제방법을 국가 예산으로 충당하고 있다(Lee et al., 2016;Hemayati et al., 2017). 그러나 본 조사의 결과에서와 같이 씨스 트선충 감염 지역은 매년 확산되어 증가하고 있다.

2011년 사탕무씨스트선충으로 동정 된 후 국가관리 병해충 으로 관리되고 있음에도 불구하고 매년 감염지역이 확산되고 있는 것은 기 발생지역에서 완전방제가 되지 않아 확산원으로 작용하기 때문으로 생각된다. 사탕무씨스트선충은 수확기 때 사용하는 각종 농기계나 운송용 자동차의 바퀴 틈에 부착되는 흙이나 인접 감염 포장의 유거수를 통해 확산된다(Kwon et al., 2016). 강원도 배추 재배농가에서는 수확 전에 미리 상인과 계 약하는 포전거래(밭떼기 거래) 형태를 취하는 농가의 비율이 가장 높은데(Kang, 2001) 포전거래를 하는 농가 포장의 경우 수확기 때에 상인들이 구매 해 놓은 포장을 옮겨가면서 자체적 으로 수확 작업을 하는데 씨스트선충의 감염지에서 비감염지 로 이동하면서 작업 시 수송장비나 작업자의 신발을 통해 전파 될 수 있다(Kwon et al., 2016). 또한 모든 농가들이 각자의 농기 계를 이용하여 개인 포장에 대한 경운작업이나 농기계 작업을 하는 것이 아니고, 한 사람의 농기계가 여러 사람들의 포장을 관리 해 주는 경우가 많기 때문에(Observation data) 씨스트선 충 감염지에서 작업 한 농기계를 통해 확산될 수도 있다. 따라 서 매년 공적방제를 통해 사탕무씨스트선충의 신규 감염지를 관리하고 있음에도 불구하고 피해 포장 수와 면적이 증가되는 것으로 생각된다. Kwon et al. (2016)도 고랭지 배추 재배지에 서 사탕무씨스트선충의 확산 방지를 위해서는 작업자의 위생 이나 농기구 및 수확과 이송 장비에 대한 세척과 같은 기본적인 방지책이 강구되어야 한다고 지적한 바 있다.

고랭지 배추 재배지에서 2011년 사탕무씨스트선충의 발생 과 피해가 확인 된 이후 2016년까지 분류적 확인 없이 토양 내 에서 씨스트 만을 분리하여 기존에 알려진 사탕무씨스트선충 으로 간주하여 발생 포장 수와 면적을 산출하였다(Table 1). 그 러나 2016년과 2017년 고랭지 배추 재배 포장에서 콩시스트 선충과 클로버씨스트선충이 혼재하는 것이 분자생물학적 방법 을 통해 확인되어(Ko et al., 2017;Okki et al., 2018) 2017년 조 사에서는 Real-time PCR기법으로 조사를 하였더니 3종의 씨 스트선충이 지역별로 다양하게 분포하였고(Table 2), 특히 배 추에 피해를 주는 사탕무씨스트선충과 클로버씨스트선충의 발 생 포장은 선충의 분자생물학적 종 동정이 이루어진 41지역 토 양 시료의 70.7%에 불과하였다. 따라서 기존에 2016년까지 사 탕무씨스트선충 발생지로 간주하였던 조사지역들의 경우 실제 배추에 피해를 주지 않는 콩씨스트선충 발생지일 가능성도 배 제할 수 없을 것으로 생각되며 추후 전반적인 실태 조사가 필요 할 것으로 생각된다. 아울러 종별 분류를 실시한 2017년 조사 시 고랭지 배추 재배지에서 먼저 확인 된 사탕무씨스트선충 (9.8%)보다 클로버씨스트선충 발생 비율(61%)이 6배 가량 높 아 클로버씨스트선충이 우점종으로 판단되나 2017년 이전의 조사지역에서 동일한 경향을 보일지는 추가적인 조사가 필요 할 것으로 생각된다. 한편 실험에 이용한 씨스트선충의 종 분석 용 진단키트 중 클로버씨스트선충용 진단키트는 H. betae와 구 별을 할 수 없는 것이었지만 Okki et al. (2018)의 선행연구에서 클로버씨스트선충으로 동정되었기에 클로버씨스트선충으로 간주하였다.

사탕무씨스트선충이나 클로버씨스트선충은 기주범위의 차 이를 보이고, 특히 선호하는 잡초의 초종이 상이하기 때문에 (Subbotin et al., 2010) 기존에 사탕무씨스트선충을 대상으로 종합적 방제전략을 강구하던 방식에 수정이 필요할 것으로 생 각된다. 즉 기존에 사탕무씨스트선충에 국한 되어 기주범위 조 사가 이루어졌던 연구(Kim et al., 2016)를 클로버씨스트선충 에 대해서도 조사가 필요할 것으로 생각되며 살선충제에 대한 반응이나 생태적 특성에 대한 추가적인 연구도 필요할 것으로 생각된다. 특히 매년 씨스트선충의 발생면적이 확대되고 있는 부분에 대해서는 국가적 차원의 종합적 관리가 절실히 필요할 것으로 생각된다.