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ISSN : 1225-0171(Print)
ISSN : 2287-545X(Online)
Korean Journal of Applied Entomology Vol.57 No.3 pp.165-175
DOI : https://doi.org/10.5656/KSAE.2018.06.0.021

Comparison of Gene Expression in Larval Fat Body of Helicoverpa assulta in Different Temperature Conditions

Wook Hyun Cha, Kwang Ho Kim1 and Dae-Weon Lee*
Department of Life Sciences, School of Chemistry and Life Sciences, Kyungsung University, Busan 48434, Korea
1Department of Agro-food Safety and Crop Protection, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Wanju 55365, Korea
*Corresponding author: daeweonlee@ks.ac.kr
May 18, 2018 June 27, 2018 July 9, 2018

Abstract


Insects are known to live at wide range of temperature, but can not survive when they are exposed to over 40°C or below supercooling point. The larvae of Helicoverpa assulta have been reared at high (35°C), low (3 to 10°C), and room temperature (25°C; control). To identify stress-related genes, the transcriptomes of fat body have been analyzed. Genes such as cuticular proteins, fatty acyl △9 desaturase and glycerol 3 phosphate dehydrogenase were up-regulated whereas chitin synthase, catalase, and UDP-glycosyltransferase were down-regulated at low temperature. Superoxide dismutase, metallothionein 2, phosphoenolpyruvate carboxykinase and trehalose transporter have been up-regulated at high temperature. In addition, expressions of heat shock protein and glutathione peroxidase were increased at high temperature, but decreased at low temperature. These temperature-specific expressed genes can be available as markers for climate change of insect pests.



온도변화에 따른 담배나방 유충 지방체의 유전자 발현 비교 분석

차욱현, 김광호1, 이대원*
경성대학교 화학생명과학부 생명과학전공, 1농촌진흥청 국립식량과학원 작물보호과

초록


곤충은 넓은 범위의 온도영역에 사는 것으로 알려져 있으나, 40°C가 넘는 고온이나 빙결온도 이하의 저온에서는 생존이 어렵다. 본 연구는 사육온도 조건이 다른 환경에서 대사중심 조직인 지방체의 유전자 발현을 분석하기 위해, 온도조건을 달리하여 담배나방을 저온 사육충 (3~10°C), 고온 사육충 (35°C)로 나누고 상온 사육충 (25°C)을 대조구로 사용하여 전사체 분석을 수행하였다. 저온에서 특이적으로 높은 발현을 보인 유전 자는 표피단백질, △9 불포화효소, 글리세롤 3-인산 탈수소효소이며, 저온에서 발현이 낮아진 유전자는 키틴 합성효소, catalase, UDP-당전이 효소이다. 고온에서 특이적으로 높은 발현을 보인 유전자는 과산화물제거효소, metallothionein 2, phosphenolpyruvate carboxykinase, 트레 할로스 운반단백질이었다. 고온에서 높고 저온에서 낮은 대조적 발현을 보인 유전자는 열충격단백질, glutathione peroxidase이었다. 이들 온도 특이적이거나 대조적 발현을 보이는 유전자는 기후변화에 관련한 특이마커로 활용이 가능할 것으로 사료된다.



    온도는 곤충의 생존에 가장 큰 영향을 미치는 물리적 요인이 다. 곤충은 넓은 범위의 온도영역에 사는 것으로 알려져 있으나, 발육이 어려운 고온이나 빙결온도 이하의 저온에서는 생존에 위협을 받는다(Neven, 2000). 농업에서 중요한 해충의 활동은 온도가 상승함에 따라 더 활발해지고, 경제적 피해크기는 증가 한다. 온도가 2℃ 상승할 때, 곤충은 연간 1~5세대 정도 생활환 이 늘어난다(Yamamura and Kiritani, 1998). 목화진딧물(Aphis gossypii Glover) 생활환은 10~25℃에서는 20~22일 정도이지 만, 30℃에서는 6~9일로 단축된다. 높은 온도는 phenoloxidase 와 lysozyme-like enzymes의 활성을 높이고, 잠재적 병원체에 대한 저항성을 높인다(Sable and Rana, 2016). 또한 발달을 저 해할 정도의 고온에 곤충이 노출되면 대사활성이 오히려 줄어 들면서 성장이 지연되기 때문에, 열충격단백질 합성을 조절을 통해 고온의 환경을 극복한다(King and MacRae, 2015). 한편 곤충의 저온에 대한 노출은 생존을 위협하기도 한다. 온도와 동 결과 같은 물리적 한계를 극복하기 위해, 곤충은 휴면이나 항동 결단백질과 같은 생존 전략을 발전시켜왔다. 저온을 극복하기 위한 내한성(cold hardiness)은 동결감수성와 내동결성으로 나 뉘며, 동결감수성은 월동하는 곤충에서 발견되는 낮은 동결점 과 관련이 있다. 내동결단백질, 높은 수준의 내동결물질, 부분 적 탈수는 동결감수성에 기여한다(Clark and Worland, 2008). 내동결성 기작은 세포바깥의 단백질 또는 빙핵에 의해 시작되 는 얼음의 형성을 조절하며, 세포막의 지질층이 주된 역할을 한 다(Zachariassen and Kristiansen, 2000; Duman, 2001).

    담배나방(Helicoverpa assulta (Lepidoptera: Noctuidae))은 고추 등의 작물에 손상을 주는 해충으로, 적절한 방제수단이 적용되지 않는다면 50% 정도의 생산성이 감소된다는 보고가 있다(Yang et al., 2004). 담배나방은 번데기 상태로 토양에서 월동하여, 다음해 6월에 우화하는 것으로 알려져 있어(Han and Lee, 1998) 내한성이 발달한 곤충으로 생각되고 있다. 또한 기 온이 높은 여름동안 생활환을 유지하고 진행하기 때문에 고온 에도 잘 적응된 곤충으로 파악되고 있다. 그러나 담배나방에서 저온에 대한 내한성 및 고온에서 생리적 반응을 유지하는데 관 여하는 유전자를 동정한 보고는 없다.

    본 연구는 담배나방에서 내한성 및 고온 적응성에 기여하는 요인을 파악하고자, 유충을 고온, 저온, 상온으로 나누어서 사 육하였다. 사육된 유충으로부터 얻은 지방체에 대해 전사체 분 석을 통해, 저온에서 발현되는 유전자군이 고온과 상온과는 차 이가 큼을 확인하였다. 저온에서 높은 발현을 보인 유전자는 구 조단백질과 지질변형효소, 당대사관련 효소인 반면, 발현이 낮 아지는 유전자군은 키틴 합성효소, 해독효소, 항산화 효소이다. 고온에서 특이적으로 높은 발현을 보인 유전자는 해독효소와 당대사관련 효소들이었다. 고온에서 높고 저온에서 낮은 대조 적 발현을 보인 유전자는 열충격단백질, glutathione peroxidase 로 동정되었다.

    재료 및 방법

    담배나방 사육

    농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 분양받은 담배나방 번 데기를 곤충사육상(60 × 60 × 60 cm, 가이아, 수원)에서 우화시 켰다. 일회용 화분에 파종한 담배를 곤충사육상에 넣어 산란을 유도하였고, 성충먹이로 10% 설탕물을 공급하였다. 담배잎에 산란한 알을 부화시키기 위해, 알이 있는 잎을 수거하여. 인공 사료가 담긴 페트리 디쉬(10 × 4 cm, 직경 × 높이, SPL(주), 포천) 에 산란된 담배잎을 옮겼다. 페트리 디쉬에서 2령 이상 사육한 후, 초파리 먹이용 용기(10 ml, Model: FFV-11010, 한솔테크, 서울)에다 인공사료(Product# F9781B, Bio-Serve, NJ, USA) 를 2 × 1 cm (가로 × 세로)로 잘라 사육용기에 한 마리씩 개체 사육하였다. 시험구의 특성에 따라 음성 대조구는 25℃ 항온 조건, 고온 사육충은 35℃ 항온 조건, 저온 사육은 3~10℃ 조건 이 유지되도록 사육하였다.

    Total RNA 추출과 차세대 염기서열 분석법을 이용한 전사체 분석

    저온(3~10℃), 고온조건(35℃)과 항온조건(25℃)에서 사육 한 담배나방이 4령 유충 1일째가 되었을 때, 지방체를 분리하였 다. RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, USA)를 사용하여 분리한 지방체로부터 total RNA를 추출하였다. Total RNA로부터 mRNA를 분리하기 위해, poly-T가 붙어 있는 magnetic bead를 사용하였고, mRNA를 절편화시켜 random primer를 이용하여 역전사 효소로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 RNaseH 를 처리하고, DNA 중합효소를 사용하여 이중 가닥의 DNA를 만들었다. 두 가닥의 DNA는 end repair mix를 통해 말단을 blunt end로 변환시킨 다음, 3′ 말단에 A 염기를 첨가하였다. 어 댑터 서열을 이중 가닥의 DNA에 결합시키고, DNA를 PCR을 통해 증폭시켰다. Illumina 기술을 이용한 차세대 염기서열 분 석법을 통해 DNA절편의 서열을 읽고 HiSeq2000 통해 염기서 열을 분석(Macrogen Inc., Seoul, Korea) 하였다.

    자료 분석

    확보한 염기서열에 대한 quality control 검정을 위해 FastQC 를 수행하였고, Trimmomatic (Ver. 0.32)를 이용하여, raw data trimming과 adaptor 서열을 제거하였다. Trinity 프로그램을 이용하여 de novo assembly를 수행하여, 유전자 염기서열인 contig들을 확보하였다. Raw data로부터 전사체의 발현을 정량 화하기 위해, RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization; Ver.1.2.15)를 이용하였다. 전사체에서 발현이 확인된 유전자는 BlastX (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)를 이용하여 유전자 를 동정하였고, BlastGO를 통해 gene ontology를 분석하였다. 각 전사체로부터 동정된 유전자군들에 대해 발현의 차이를 대 조구와 비교하였다. 본 연구에 사용된 전사체 정보는 NABIC (http://nabic.rda.go.kr)에 등록하였다(NN-1653-000001, NN- 1660-000001, NN-1862-000001).

    결과 및 고찰

    저온(3~10℃), 고온(35℃) 및 상온(25℃)에 노출된 담배나방 4령 유충 지방체로부터 추출한 total RNA를 추출하고, mRNA를 정제하였다. 정제된 mRNA를 cDNA로 변환시킨 후, Illumina HiSeq2000 시스템을 이용하여 101 bp paired-end 시퀀싱을 통 해 전사체 염기서열을 확보하였다. 얻어진 1차 서열(raw read) 에서 얻은 공통 서열을 기반으로 Trinity 프로그램을 이용하여 총 70,557,160개의 염기로 구성된 85,445개의 contig를 얻었다 (Table 1).

    발현 전사체를 기반으로 BlastGO 프로그램을 이용하여 Gene ontology (GO) 분석을 실시하였다. 전체 contig 중에서 64%는 GO 유전자들과 상동성을 보이지 않았으나, 36%의 contig는 각 각 생물기능(14%), 분자기능(12%) 및 세포작용(10%)는 GO 분류군으로 확인되었다. 생물기능에서 가장 많은 기능군은 각 각 대사, 조절, 단세포 작용 및 세포작용으로 나타났고, 분자기 능에서는 결합, 촉매작용 및 수송 기능군으로 나타났다. 한편 세포작용에서는 세포영역과 세포소기관 및 세포막의 발현 유 전체로 나타났다(Fig. 1).

    필수 유전자에 대한 발현 분포 분석(Database of essential genes (DEG))을 이용한 온도 조건을 달리한 담배나방 유충 지 방체의 유전자 발현 분포는 저온:상온 또는 고온:상온 간의 대 략적인 유전자 발현 분포에서 큰 차이를 보이지는 않았다(결과 미제시).

    또한 사육온도 조건을 달리한 담배나방의 전사체에 대한 상 대적 발현분포 분석에서, 저온 사육충과 고온 사육충의 일부 유 전자의 발현이 대조구에 비해 유전자 발현의 차이가 있음을 확 인하였다. 25℃에서 발현되는 유전자들과의 차이를 보이는 유 전자들은 사육온도 조건에 따라 특이적으로 발현되는 유전자 일 개연성이 높다고 할 수 있다. 또한 각 발현유전체간의 발현 유사도는 상온(25℃)과 고온(35℃)는 0.92로 매우 높은 상관성 을 보인 반면, 고온:저온, 상온:저온 간의 상관성은 각각 0.78과 0.77로 상대적으로 낮았다. 이것은 상온에서 발현되는 유전자 가 저온보다는 고온에서 발현되는 유전자와 특성이 비슷하였다.

    저온에서 사육된 담배나방의 지방체 전사체에서 정상온도 사육개체의 발현유전체에 비해 4,319개의 contig의 발현양이 높아지고, 발현양이 감소한 contig는 4,491개로 나타났다. 고온 에서 사육된 개체의 지방체 발현유전체에서 정상온도 사육개 체 발현 유전체에 비해 2,245개 contig가 발현이 증가한 반면, 발현양이 감소한 contig는 1,779개였다. 이것은 상대적으로 저 온조건의 사육개체에서 발현되는 유전자의 발현차이가 클 수 있음을 보여주었다.

    다른 사육온도 조건에서 얻은 지방체 발현 유전체를 hierarchial clustering을 한 결과, 대조구(25℃ 사육)와 고온사육 개체의 지 방체 발현 전사체는 같은 클러스터를 형성하였으나, 저온사육 개체의 지방체 발현 전사체는 outgroup처럼 떨어진 것으로 보 아, 유전자 발현에서 차이가 있음을 추정할 수 있었다(Fig. 2). 사육된 개체의 지방체의 전체적인 유전자 발현 차이를 알아보 기 위해서 heat map 분석을 수행하였다. 대조구(25℃ 사육)에 비해, 저온 및 고온에서 사육된 개체의 지방체에서 온도 특이적 인 유전자 발현이 있음을 확인할 수 있었다. 이것은 저온 또는 고온에 특이적인 유전자 발현이 있음을 보여주었다(Fig. 2).

    온도조건에 따라 지방체에서 발현되는 유전자 탐색을 위해, 구조단백질(structural protein), 열충격단백질(heat shock protein), 항산화효소(antioxidant enzymes), 해독작용(Detoxification enzyme), 지질 변화(enzymes for lipid modification), 내동결성 물질 합성과 이동(cryoprotectant-related proteins)의 전사체를 동정하였다. 물리적 환경변화에 관련하여 구조단백질에 속하 는 표피 단백질(cuticular protein)은 탈수에 대한 저항성 증가 와 관련하여 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Andersen, 2010; Sugumaran, 2010; Vincent, 2009). 특히 스트레스에 대 한 노출은 glycine이 풍부한 표피단백질의 발현을 유도하는 것 으로 알려져 있다(Bouhin et al., 1992; Zhang et al., 2008). 담배 나방 지방체의 전사체로부터 확인된 표피단백질의 contig는 58 개이며, 저온전사체의 contig가 대조구나 고온 전사체의 contig 보다 발현양이 대체로 높았다(Table 2). 이것은 표피단백질의 발현의 차이가 주로 저온에 관련된 스트레스와 더 밀접한 관련 성이 있는 것으로 사료된다. 또한 표피층의 주성분이 키틴(chitin) 의 생합성에 관련된 효소들도 동정되었는데, 저온 발현체의 키 틴합성효소(chitin synthase)는 상온 또는 고온 발현체에 비해 낮았다. 이것은 저온에서 발육의 속도가 늦어지고, 탈피에 필요 한 표피 합성이 활발히 일어날 필요가 없는 조건이기 때문인 것 으로 파악된다(Table 2).

    열충격단백질은 stress와 관련된 환경조건에 대한 반응으로, 세포가 만들어 내는 단백질을 말한다. 열충격단백질은 대부분 의 생물체에서 발현되고, 곤충에서는 열과 탈수 stress에 대해 보호기능을 하는 것으로 알려져 있다(Goto and Kimura, 1998). 발견 초기에는 열충격에 주로 관련이 있는 것으로 보고되었으 나, 저온, 자외선, 조직의 재구성 등에 관여하는 것이 밝혀졌다 (Štětina et al., 2015; Colinet et al., 2010; Sang et al., 2012; García-Reina et al., 2017). 일반적으로 모든 생명체는 환경의 갑작스런 변화에 대응하는 방어체계들이 있으며, 열충격단백 질은 세포가 외부의 해로운 자극에 노출되면 생성되어 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다(Cai et al., 2017; Basha et al., 2012). 이 열충격단백질은 온도가 갑자기 상승했을 때, 세포에 서 합성되는 단백질로 고온 이외에도 여러 가지 다양한 자극에 대한 반응으로 단백질을 합성할 수 있다고 하여 스트레스 단백 질이라고도 한다. 열충격으로 인해 유도되는 유전자들로부터 발현되는 단백질은 분자량이 10~100 kDa로 다양하며, 크기에 따라 Hsp60, Hsp70 및 Hsp90 family 등으로 분류 한다(King and MacRae, 2015). 30 kDa 이하의 열충격단백질은 아직 생물 학적 기능이 밝혀지지 않았으며, Hsp40은 Hsp70의 co-factor 로 알려져 있고, Hsp60은 단백질 접힘, Hsp70은 단백질 접힘 뿐만 아니라 heat stress에 대해 내열성을 갖게 한다. Hsp90은 스테로이드 수용체 및 전사인자(transcription factor)로 작용하 며, Hsp104와 Hsp110은 극한 온도의 내성을 갖게 한다. 이 중 가장 많이 연구된 Hsp70은 자극을 받았을 때만 급격하고 민감 하게 반응하여 상당한 양의 증가를 보인다. 담배나방의 지방체 에서 Hsp60, Hsp68, Hsp70, Hsp90의 contig가 확인되었다 (Table 3). 저온 발현체보다는 고온 발현체에서 열충격단백질의 발현이 증가되는 경향을 보였는데(Table 3), 이것은 고온스트 레스에 대한 효과를 완화시키기 위한 반응으로 이해할 수 있다.

    활성산소는 주로 호기성 대사, 생식 및 환경적 요인에 의해 야기된다. 활성산소의 과도한 생성은 생체분자에 손상을 주는 산화스트레스를 일으키고 세포 손상과 수명에 영향을 주게 된 다(Guarente and Kenyon, 2000; Cutler, 1991; Dröge, 2002; Finkel and Holbrook, 2000; Tasaki et al., 2017). 항산화효소의 기능을 가진 효소로는 catalase, superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase 등이 있으며, 이들은 주로 소포체나 세 포질에서 생화학반응으로 인한 활성산소를 과산화수소로 변환 시켜(SOD), 물로 전환(catalase, glutathione peroxidase)시켜 항산화 작용에 참여 한다(Aucoin et al., 1991; Wang et al., 2001; Weirich et al., 2002; Lomate et al., 2015). 따라서 이들 효소들 은 활성산소의 공격으로 나타난 생성물에 대한 방어와 관련된 중요인자로 여겨지고 있고(Halliwell, 2007), SOD는 직접적으 로 superoxide 음이온 생성에 관여하기도 하지만, 독성을 가지 는 과산화수소(H2O2)을 생성하기도 한다(Tasaki et al., 2017). 담배나방의 온도 발현 전사체에서 항산화 관련 효소들은 확인 하였다. 활성산소를 과산화수소로 전환시키는 SOD는 고온 전 사체에서 발현이 증가하였고, 저온발현 전사체와 대조구는 큰 차이를 보이지 않았다(Table 4). 과산화수소를 물로 전환시키 는 catalase는 1개의 contig가 동정되었고, 저온 전사체에서는 발현이 감소하였으나, 대조구와 고온 전사체에서 큰 차이를 보 이지 않았다. 한편 catalase와 같이 과산화수소를 물로 전환시 키는 glutathione peroxidase는 6개의 contig가 확인되었고, 저 온 전사체에서는 유전자 발현이 감소한 반면, 고온 전사체에서 는 발현이 비슷하거나 증가되었다. 이것은 저온조건보다는 고 온조건에서 물질대사가 활발히 일어남에 따라 관련유전자의 발현도 증가되는 것으로 이해할 수 있다(Table 4).

    온도와 같은 물리적 환경변화와 관련된 해독작용에서는 Cytochrome P450, metallothionein 2 및 UDP-glycosyltransferase, Glutathione S transferase 등이 관여한다. cytochrome P450 효 소는 곤충의 모든 조직에서 발현되는 단백질로, ecdysteroid와 유약호르몬의 합성과 분해로부터 외래물질의 대사(해독작용을 포함)에 이르는 다양한 생화학적 역할을 수행한다(Feyereisen, 1999). 이러한 다양한 기능은 다양한 구조에 의한 것으로 곤충 의 유전체에 약 100여개의 유전자들이 존재한다. Cytochrome P450는 복잡한 조절을 통해 곤충의 저항성 발달에 중요한 역할 을 한다(Li et al., 2007; Hemingway et al., 2004). 이것은 유전 자의 다형성을 통해 다양한 물질에 대한 해독작용을 효과적으 로 증대할 수 있는 분자기작으로 이해할 수 있다. 담배나방의 발현 전사체에서 Cytochrome P450의 10개 contigs를 확인하 였다. 저온 전사체에서는 CYP4, 6a2, 12 family의 발현이 감소 된 반면, 고온 전사체는 CYP6a17, 6d4, 9f2의 발현이 증가하 였다. 고온 전사체에서 CYP9 family 발현은 대조구보다 높았 으며, 저온 전사체는 대조구보다 높거나 비슷하였다.

    Metallothionein은 cyteine이 풍부한 단백질로 골지체에 위 치한다. 이 단백질은 생리적으로 중요한 금속이온(Cu, Zn, Se) 과 외래 금속이온(Cd, Hg, Ag)등에 결합하여 산화스트레스로 부터 세포를 보호한다(Sharma, et al., 2013; Ruttkay-Nedecky et al., 2013; Andrews, 2000; Klaassen et al., 2009). 따라서 metallothionein은 superoxide나 hydroxy radical과 같은 위해 한 산화물을 포획하여 해독과정에 관여한다. 담배나방의 전사 체에서는 1개의 contig를 동정하였고, 저온과 고온 발현체 모두 대조구에 비해 유전자 발현이 증가함을 확인하였다(Table 5). UDP-glycosyltransferase (UGT)는 작고 다양한 소수성 분자 를 가지는 활성화된 당(sugar) 공여자인 UDP-glycoside에서 당화(glycosylation) 촉진에 관여 한다(Ahn et al., 2012). UDPglycosyltransferase는 해독작용 뿐만 아니라 세포의 경화반응 (Hopkins and Kramer, 1992), 색소화반응(Wiesen et al., 1994; Mizokami and Yoshitama, 2009) 및 감각(Robertson et al., 1999; Wang et al., 1999; Ahn et al., 2011)에도 관여하는 것으로 알려 져 있다. 담배나방의 전사체에서 2개의 UDP-glycosyltransferase contigs를 확인하였다. 고온전사체는 대조구와 큰 차이를 보 이지 않았으나, 저온 전사체에서는 유전자 발현이 감소하였다 (Table 5).

    Glutathione S transferase (GST)는 해독작용을 위해 외래물 질에 환원형 글루타치온이 붙도록 촉매한다. GST는 크게 6개의 subfamily (delta, epsilon, omega, sigma, theta, zeta)로 나눈다 (Fang, 2012). GST의 주된 기능은 외래물질을 해독하여 세포 에 중요한 단백질이나 핵산이 반응하지 못하도록 하는 것으로 알려져 있다(Ranson and Hemingway, 2005). 담배나방의 발현 전사체에서 9개 contig가 확인되었고, 저온 전사체는 D1, E2, E4, O3 isoform의 발현이 증가하였고, 고온 전사체는 D1, D7 isoform의 유전자 발현이 증가하였다(Table 5).

    지방체 내의 지질조성 변화와 관련하여 지방산 △9 불포화 효소 및 phospholipase A를 활성화시키는 단백질과 enoyl-CoA hydratase가 관여한다. 세포막 지방체가 액상 상태에서 고형화 되는 gel 상태로 변화하는 것은 비동결 상태에서 저온으로 인한 손상을 유발시키는 중요한 인자 중의 하나이다(Drobnis et al., 1993). 불포화지방산 농도 증가는 저온에서 세포막의 액상 결정 상태를 유지하는 데 중요한 역할을 한다. 또한 이러한 변화는 저온에 대한 곤충의 내한성(cold tolerance)과 휴면과 관련되어 있기 때문에 막 인지질의 구성이 매우 중요하다(Bashan, 2005). 지방산 △9 불포화효소는 세포막에 있는 포화지방산에 특정위 치에 탄소와 탄소간의 이중결합을 첨가함으로써 물질에 대한 불포화도를 증가시키는 역할을 한다(Chung and Carroll, 2015). 곤충 조직 내에서의 △9 불포화효소의 다양한 분포는 항상성 유지에도 중요한 역할을 한다(Eigenheer et al., 2002). 담배나방 의 발현 전사체에서 4개 지방산 △9 불포화효소에 대한 contigs 를 동정하였고, 앞서 기술한 바와 같이 내한성에 관여하는 유 전자이기 때문에 이 유전자의 발현은 저온 전사체에서 모두 높 게 나타났다(Table 6). 반면 고온 전사 발현체는 대조구와 차이 가 없었다(Table 6). 이것은 지방산 대사가 내한성에 대한 여부 를 결정하는 중요한 표적유전자가 될 수 있음을 시사해준다. Phospholipase A2 (PLA2)는 glycerol의 두 번째 탄소로부터 지 방산을 분리하는데 관여하는 효소로 특히 인지질의 sn-2 acyl bond을 인지하여 arachidonic acid (AA)와 lysophospholipid을 방출하도록 가수분해를 촉진한다. AA는 cyclooxygenase에 의해 prostaglandin (PG)으로 변화되고, PG는 생식, 분비, 면역 등의 다양한 생리적 기능에 관여한다(Stanley and Kim, 2014; Kim et al., 2018). 1개의 contig를 확인하였고, 저온 전사체에 서 발현이 증가하였다(Table 6).

    내동결성물질의 합성과 이동에는 Glycogen phosphorylase, Phosphoenolpyruvate carboxykinase, Trehalose transporter, Glycerol-3-phosphate dehydrogenase 등이 관여한다. 내동결 성 물질은 지방체에서 합성되며, 내동결성 물질을 만드는 중요 한 생화학 반응은 저장된 glycogen을 활용하는 과정에서 시작 하여, 내동결성 물질을 만드는데 관여하는 효소의 활성에 의해 혈림프 내의 폴리올들이 생합성 되는 것이다(Park and Kim, 2013; Cha and Lee, 2016). Glycogen phosphorylase 활성은 저온 적응성을 가지는 유충에서 glycerol부터 sorbitol 합성에 이르기까지 온도와 관련된 반응의 스위치 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Park et al, 2014; Park and Kim, 2013; Kim et al., 2017). 담배나방 지방체로부터 1개 glycogen phosphorylase contig를 확인하였고, 저온 및 고온 전사체에서 모두 발현이 감소 하였다(Table 7). Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPK) 는 저온 및 고온 스트레스에서 포도당의 빠른 이동에 관여하며, triglyceride/fatty acid cycle을 조절한다. 담배나방 지방체로 부터 1개 PEPK contig를 확인하였고, 고온전사체에서만 발현 이 증가하였다(Table 7).

    Trehalase (Treh)는 두 개의 glucose 분자 생성을 위해 trehalose 를 가수분해하는데 관여하고 에너지 대사에서의 중요한 역할과 함께 chitin 생합성 경로에서 나타나는 첫 번째 효소로 성장, 탈 피, 변태 및 생식 등의 다양한 생리대사에서 중요한 역할을 한다 (Thompson, 2003; Shukla, et al., 2015). 곤충에서는 수용성 형 태(Tre-1)와 막에 결합된 형태(Tre-2)로 존재하며, trehalose와 trehalose 대사는 곤충의 생존에 결정적이다(Mitsumasu et al., 2005; Mori et al., 2009; Takiguchi et al., 1992). Trehalose 합성에 서 가장 잘 알려진 경로는 trehalose-6-phosphate synthase (TPS) 로 두 분자의 포도당이 UDP와 반응하여 uridine-5‘-diphosphoglucose (UDPG)가 되고, UDP와 분리되어 포도당-6-인산이 된 다. Trehalose-6-phosphate (T6P)의 생성경로는 T6P 탈수소효 소에 의해 trehalose로 전환된 후, 이동단백질을 이용하여 체내 이동된다. 담배나방의 고온 전사체에서만 Tre1의 발현이 대체로 증가하였으며, 고온에 의한 활발한 물질대사와 관련이 있는 것 으로 파악된다(Table 7). Glycerol-3-phosphate dehydrogenase는 dihydroxyacetone phosphate (DHAP)를 glycerol-3-phosphate (G3P)로 전환하거나 가역적으로 G3P를 DHAP로 전환시키는 효소이다. 따라서 저온 상태에서 지방체 내 글리세롤 생합성으 로 가는 중요한 효소이기도 하지만, 에너지를 만드는 과정에서 글리세롤로부터 DHAP를 만들어 해당과정을 통해 에너지를 생성하여 글리세롤 농도를 낮출 수 있다. 저온 전사체에서 G3P dehydrogenase contig는 유전자 발현이 감소되었으나, 고온 전 사체에서는 대조구와 큰 차이를 보이지 않았다(Table 7).

    이상의 결과를 종합하면, 온도조건을 달리한 환경에 노출된 담배나방의 유충은 특정온도 조건에 유전자의 발현 패턴이 달 라짐을 알 수 있다. 저온에서 높은 발현을 보인 유전자는 표피 단백질, △9 불포화효소, 글리세롤 3인산 탈수소효소이며, 저온 에서 오히려 발현이 낮아진 유전자는 키틴 합성효소, catalase, UDP-당전이효소이다. 고온에서 높은 발현을 보인 유전자는 과 산화물제거효소, metallothionein2, phosphenolpyruvate carboxykinase, trehalose 운반체단백질이었다. 고온에서 높고 저온에 서 낮은 대조적 발현을 보인 유전자는 열충격단백질, glutathione peroxidase이다. 이들 온도 특이적이거나 대조적 발현을 보이 는 유전자는 기후변화에 관련한 특이마커로 활용이 가능할 것 으로 사료된다.

    사 사

    본 논문은 농촌진흥청 공동연구사업(과제번호: PJ012307)의 지원에 의해 이루어진 것임.

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    Gene ontology of the fat body transcriptome in Helicoverpa assulta. All contigs from cDNA of the fat body in H. assulta were converted into six-frame translational products and GO-annotated from protein sequence database of NCBI. The proteins with associated GO terms, molecular function, biological process and cellular component were grouped.

    KSAE-57-165_F2.gif

    Heat map of two-way hierarchial clustering using Z-score for normalizing value among fat body transcripts in H. assulta. The red areas indicate temperature-specific gene expression.

    Summary of the statistics of RNA-Seq and de novo assembly of Helicverpa assulta fat body cells

    Structure-related protein genes identified from fat body transcriptome of Helicoverpa assulta

    Heat shock proteins identified from fat body transcriptome of Helicoverpa assulta

    Antioxidant enzymes identified from fat body transcriptome of Helicoverpa assulta

    Detoxification genes identified from fat body transcriptome of Helicoverpa assulta

    Lipid modification genes identified from fat body transcriptome of Helicoverpa assulta

    Cryoprotectant mobilization genes identified from fat body transcriptome of Helicoverpa assulta

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