곤충 병원성 미생물들은 곤충의 면역반응을 교묘하게 회피 하고 체내에서 번식하여 곤충을 병들고 치사케 한다. 그러나 곤 충은 체내에 침입한 병원성 미생물들을 빠른 시간 내 인지하고 미생물들에 대항하는 면역반응을 시작한다. 곤충의 면역반응 은 혈구세포들에 의한 세포성면역(Cellular immune)과 다양한 항생/항균단백질(Antimicrobial peptides)들을 이용하여 미생 물들을 제거하는 체액성면역(Humoral immune)으로 구분되어 외부물질들에 대항한다(Lavine and Strand, 2002; Lemaitre and Hoffman, 2007; Strand, 2008; Vlisidou and Wood, 2015). 이러 한 곤충 면역반응의 시작과 유도는 병원성 미생물들로부터 기 원되는 물질(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) 들에 의하여 야기되며 이러한 물질들은 병원성 미생물들의 종 류에 따라 구분되고 있다.

그 예로 베타글루칸(β-glucan)은 세균과 곰팡이의 세포벽에 서 자연스럽게 발생되는 다당류(β-D-glucose polysaccharides) 이며 특히, 곰팡이의 세포벽에서 발생되는 베타글루칸(β-1,3- glucan)은 곤충 체내에 존재하는 그램음성결합수용체(Gram Negative Binding Proteins, GNBPs)와 결합되어 세린단백질 가수분해효소(serine protease cascade) 신호체계를 활성화 시 키고 최종적으로 체액성, 세포성면역반응을 수행한다(Lemaitre and Hoffman, 2007; Bang et al., 2015). 이러한 연구는 초파리 (Drosophila melanogaster)를 대상으로 자세히 연구 되었고 특 히, 초파리(D. melanogaster)는 3종류의 그램음성결합수용체 (GNBP 1, 2, 3)가 존재하는 것으로 알려져 있다. 흰점박이꽃무 지(Protaetia brevitarsis seulensis)의 경우도 최소 2종류의 그 램음성결합수용체가 존재하며 면역반응을 유도하는 것으로 보 고되었다(Bang et al., 2015). 라이신형펩티드글리칸(Lys-type Peptidoglycan), 리포테이코산(lipoteichoic acid, LTA), 디아미 노피멜산형펩티드글리칸(Diaminopimelic acid-type PGN)의 경우는 그람음성세균(Gram negative bacteria)의 주요 구성성 분이며 특히 디아미노피멜산형펩티드글리칸의 경우 세포벽 주 요성분으로서 곤충면역결핍(Insect immune deficiency, IMD) 신호전달 체계를 활성화 시키는 물질로 알려져 있다. 이러한 물 질은 곤충의 다양한 단백질들과 반응을 시작으로 최종적으로 항생/항균단백질들을 발현시켜 미생물을 인지/제거하는 것으 로 알려져 있다(Ferrandon et al., 2007; Buchon, 2014).

곤충 면역시스템을 활성화 시키는 미생물 기원물질들을 분 자패턴인식단백질(Molecular Pattern Recognition Proteins; microbial peptidoglycan, lipopolysaccharides, β-glucans, lipoproteins, CpG dinucleotides, or flagellin)이라 하며 이러한 물질들은 위에서 서술된 곤충의 그램음성결합수용체와 같은 패턴인지수용체(Pattern recognition receptors, PRRs)와 결합 하여 면역반응의 유도 및 면역반응을 시작한다(Shelby and Popham, 2012). 흰점박이꽃무지(P. brevitarsis seulensis)의 경 우는 현재까지 8종류의 패턴인지수용체(PGRP-1, 2, 3, LB, LC, LE, SC2, SC3)들이 존재하는 보고되었고 이들 수용체들 은 병원성 미생물 감염 후 과 발현되어 면역반응을 유도 하는 것으로 알려져 있다(Bang et al., 2015). 위와 같이 곤충 면역반 응을 유도하는 미생물 유래 물질들은 주로 미생물들의 세포벽 주요구성성분들이고 이러한 물질들만을 대상으로 곤충 면역과 연관되어 대한 많은 연구가 진행되었다.

그러나 다양한 병원성 미생물들은 성장하면서 수많은 물질 (대사체, Metabolites)들을 배양액에 분출하며 성장한다. 이러 한 미생물 분비물질들은 기주의 질병발생, 면역유도, 면역억제, 미생물과 공생, 진화 등 다양한 반응을 유도 하는데 이러한 연 구는 포유동물을 대상으로 매우 활발히 진행되고 있다. 예를 들 어 장(Gut)내에 공생하는 미생물과 공생균에 의하여 배출되는 분비물질들이 면역을 유도하거나 억제 시키는 기작과 암 발생, 천식, 염증, 소화기능 장애, 당뇨에 이르기까지 많은 분야가 병 원성 미생물자체 뿐 아니라 분비물질과도 깊은 연관이 있음을 보고 하였다(Brestoff and Artis, 2013; Rooks and Garett, 2016). 하지만 초파리(D. melanogaster)를 포함 곤충을 대상으로 미생 물들의 분비물질과 기주의 질병, 면역 등에 대한 상호 관계 있 는지 또한 분비물질 자체가 곤충 면역을 유도하는지에 대한 연 구는 거의 없는 실정이다.

본 연구는 미생물 분비물질 자체가 곤충 면역반응을 유도하 는지에 대한 조사로서 흰점박이꽃무지(P. brevitarsis seulensis) 에 대한 병원성 세균과 공생균을 이용하였다. 본 연구자들은 최 근 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.)이 흰점박이꽃무 지(P. brevitarsis seulensis)의 장(Gut)에 존재하고 기주의 면역 반응을 회피 할 수 있는 공생균이고 대장균(E. coli K-12)은 매 우 강한 병원성을 야기하는 미생물로 보고하였다(Lee et al., 2016). 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.)과 대장균(E. coli K-12)을 동일한 조건에서 배양 하고 배양된 세균들은 제거 한 후 다양한 분비물질들이 존재 할 거라 예상되는 배양액만을 유충에 주사하여 면역반응 여부를 조사하였다. 추후에 대장균 (E. coli K-12)에 의하여 분출되는 분비물질들과 크리세오박테 리움(Chryseobacterium sp.) 분비물질들 차이를 비교하여 면역 과 관련된 분비물질들을 모두 동정한다면 미생물 분비물질들 하나하나에 대한 곤충 면역 신호전달체계를 연구할 수 있는 기 초를 제공 할 것이다. 동시에, 미생물 대사물질만 이용 면역 활 성화, 억제, 질병예방, 치료 등 다양한 병리학 분야에도 적용 가 능할 것으로 판단한다.

재료 및 방법

공시 곤충

본 연구에 이용한 흰점박이꽃무지(P. brevitarsis seulensis) 유충은 Kwon (2009)에 의한 방법으로 사육하였다. 사육 온도 는 25 ± 1℃, 광조건은 16:8 (L:D) h, 상대습도는 60 ± 10%로서 살균된 오크나무 톱밥을 먹이로 제공하면서 사육하였다.

흰점박이꽃무지(P. brevitarsis seulensis) 유충 장(Gut) 내 미생물 분리 및 배양

유충 장내 미생물의 분리 및 동정은 기존 방법에 의거 하에 진행하였다(Lee et al., 2016). 간단히 설명하면, 장이 적출될 4 령 유충은 95% 알코올에 서 10분간 큐티클(Cuticle) 표면을 소 독하였다. 해부현미경(Leica DM IL LED)하에서 중장(Midgut) 과 종장(Hindgut)을 적출하고 초음파분쇄기에서 분쇄 한 후 PBS 버퍼(NaH₂PO₄, Na₂HPO₄ and NaCl (pH = 7.2))에서 3반 복 하여 세척하였다. 약 ~500 μl 상층액은 4℃에서 15분간 3,000 rpm으로 원심분리 하여 상층액과 조직을 분리하였다. 상 층액은 마이크로 필터(0.22 μm)를 사용하여 필터 한 후 미생물 배양 고체배지 (SOC starch agar plates; 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 8.56 mM NaCl, 2.5 mM KCl, _ddH₂O to 1000 mL, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 30 mM glucose)에서 37℃에서 48시간 배양하여 미생물을 분리하였다. Lee (2016) 등에 의하여 보고 된 바와 같이 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.; KX371567)을 분리하여 공생균주로 사용 하였다. 대장균(E. coli K-12)를 포함하여 분리된 균주는 액체배양(LB media)을 24시간 진행 한 후 4℃에서 10분간 13,000 rpm 원심분리를 진 행하여 펠렛은 완전히 제거 하였다. 상층액은 다시 한 번 같은 조건으로 원심분리하여 배양액만 주입에 사용하였다. 균들이 완전히 제거가 되었는지 여부는 상층액을 1 ml를 고체배지에 도포하여 48시간 배양하여 콜로니(colony)생성 여부를 재확인 하여 배양액만 있는지를 다시 한 번 확인 확인하였다. 분리된 배양액 10~40 μl를 직접 유충 혈강내 주입하여 생존율, 병원성 여부, 혈구세포들의 면역 활성화를 관찰 하였다. 병원성 여부 및 생존율 분석은 카플란-마이어 분석(Kaplan Meier survival) 방법을 사용하였고 혈구세포들의 면역반응은 혈구세포의 리소 좀(Lysosome) 활성화를 지표로 사용하였다.

혈림프(hemolymph) 채혈, 혈구세포 염색, 유세포분석(Flow cytometry) 및 생존율 조사

혈림프 채혈은 4령 유충의 등(Dorsal) 부분을 70% 에탄올 (Etanol)을 사용하여 멸균 한 뒤 유리 파스츄어피펫(Pasteur pipette; > 2mm) 채혈기를 사용하여 약 ~500 μl의 혈림프(Hemolymph) 를 추출하였다. 혈림프는 항응고제(98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 17 mM EDTA, 4 1 mM citric acid, pH 4.5)를 이용 하여 약 1:1 비율로 혼합하였고 4℃, 1,000 g 에서 10 분 간 원심 분리 한 후 혈구세포들을 관찰 하였다. 혈구세포들은 세포내 리 소좀(Lysosome)만 특별히 염색하는 LysoTracker Red (7.5 nM; Molecular Probes)시약을 사용하였다(Kwon et al., 2014). 시약 과 30분간 실온에서 배양 한 후 3분 간격으로 3반복 PBS buffer (137 mM Sodium Chloride; 10 mM phosphate; 2.7 mM Potassium Chloride; pH = 7.4)로 세척 후 현미경으로 관찰하고 유세포분 석기(BD Bioscience; San Jose, CA)를 사용하여 혈구세포를 분석하였다(Kwon et al., 2014). 배양액 주입 후 면역반응 유도 시간은 12~180시간으로 정하였으며 표준통계 소프트웨어 프 로그램을 사용하여 통계 분석하였다(IBM SPSS statistics 22.0).

현미경(Microscopy)관찰

혈구세포들 관찰을 위하여 라이카 현미경(Leica DM2500 upright and Leica DMI 3000B inverted fluorescence microscopes), 컨포컬(Olympus FV1000 confocal microscope)현미 경을 사용하였다.

결과 및 고찰

미생물 배양액 주입과 생존율

본 연구는 미생물 분비물질 자체가 곤충 면역반응을 촉발하는 지에 대한 연구로서 재료 및 방법에 묘사한 것과 같이 두 종류의 미생물을 배양, 이용하였다. 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.)은 흰점박이꽃무지(P. brevitarsis seulensis)의 장(Gut)에 존재하는 공생균이며 대장균(E. coli K-12)은 주입(10⁶ colonyforming units (CFU)) 72시간 후 유충의 50% 이상을 사망케 하 는 강력한 병원성 미생물이다(Lee et al., 2016). 이러한 결과와 정보를 바탕으로 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.)과 대장균(E. coli K-12)을 24시간 동일한 조건, 동일한 양을 배양 하였다(10⁶ CFU). 배양 후 3번의 원심분리를 통하여 배양된 세 균자체를 완전히 제거 하였다. 배양균 제거 여부는 세균이 제거 된 배양액 500 μl를 고체배지에 도포하여 72시간 재 배양하여 콜로니 형성 여부를 확인하였고 72시간 이후에도 콜로니가 전 혀 형성되지 않는 것을 확인 한 후 아래 실험을 진행하였다.

대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media), 단순 배양액(LB media), 공생균인 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액(Ch media)을 주입 비교하여 면역 활성화 여부를 확인 하였다(Fig. 1A). Fig. 1A와 같이 병원균 배양액(Ec media)을 주입 한 그룹은 주입 150시간 이후 ~60% 이상의 유충이 사망 하였으나 공생균 배양액(Ch media) 주입 유충은 주입 150시간 이후 ~60% 이상 생존하고 있음을 확인 하였다(Fig. 1A). 단순 배양액(LB media) 주입 그룹은 ~80% 이상 생존하는 것을 관찰 하였다. 주입 180시간 후 병원균 배양액(Ec media) 주입 그룹은 ~30% 이하, 공생균 배양액(Ch media) 주입 그룹은 ~60% 이상 생존율을 나타냈으며 컨트롤 그룹은(LB media) ~80% 이상 생 존하고 있음을 최종적으로 확인하였다(Fig. 1A). 결론적으로, 단순 배양액(LB media), 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액과 비교하여 병원균인 대장균(E. coli K-12) 배양액 (Ec media)에는 곤충의 병원성을 야기하는 분비물질(Metabolites; pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)들이 다량으 로 존재하고 이러한 분비물질들이 곤충의 면역반응을 촉발하 여 곤충이 생존하거나 또는 이러한 물질들에 의하여 사망하는 것으로 판단 할 수 있었다.

이러한 곤충 면역반응의 여부는 Fig. 1B에서도 확인 할 수 있었다. 유충에서 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media)을 주 입한 주사 자리가 72시간 이후부터 멜라닌화(melanization)화 강하게 진행되었고 180시간까지 지속적으로 유지되면서 유충 이 죽거나 강한 면역반응으로 건강하지 못 한 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 1B). 그러나 단순 배양액(LB media)과 크리세오박 테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액이 주입된 유충들은 72 시간을 지나면서 멜라닌화는 감소되거나 차츰 없어지는 것을 관찰 할 수 있었다(Fig. 1B). 강한 갈색의 멜라닌화(Melanization) 는 곤충 면역반응 지표 중 하나로서 곤충의 프로페놀옥시다아 제(prophenoloxidase) 활성화에 따른 곤충 세포성, 체액성 면역 반응으로서 패턴인지수용체를 비롯하여 세린단백질도 관여하 는 것으로 알려져 있다(Lu et al., 2014).

위의 결과와 같이 배양액만 주입 한 후 면역반응이 촉발되는 것은 아마도 배양액내에 존재하는 다양한 분비물질들이 유충 의 면역반응을 촉발하는 것으로 추측 할 수 있다. 병원균인 대 장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media)에 존재하는 다양한 분비 물질들에 대한 연구는 매우 활발히 진행되었다. 동시에, 다양한 분비물질들에 관련된 모든 자료는 ECMDB (E. coli Metabolome Database, ecmdb.ca)에서 찾아 볼 수 있다. 특히 위 자료는 대장 균 대사경로데이터베이스(metabolic pathway database)를 바 탕으로 분비물질들의 정보를 제공하는데 약 3,700개 이상의 작 은 분자량 물질, 1,400개 이상의 효소와 연관된 물질, 380개 이 상의 수송체(Transporters) 물질, 3,000개 이상의 분비물질이 등록 되어있다(Sajed et al., 2015). 이러한 수많은 물질 중 특히, D-Mannose, LPS (1-O-antigen), LPS (4-O-antigen), Ra-LPS, N-Acetyl-alpha-neuraminate 등은 동물의 면역반응도 촉발하는 물질들로 보고되고 있다. 특히, D-Mannose는 글루코스(Glucose) 와 연관된 당(sugar)형태로 모기(Aedes albopictus)의 침샘에서 C-type lectin과 결합하는 특성을 갖고 면역반응을 야기하는 것 으로 보고되고 있다(Cheng et al., 2014). 또한 다양한 종류의 리 포다당류(lipopolysaccharide, LPS)들은 곤충의 면역을 강하게 야기하는 병원성발현분자들인 분자패턴인식물질로서 수많은 연구가 곤충을 대상으로 연구되었다. 이러한 물질들은 최종적 으로 곤충의 항생단백질들 발현을 유도하거나 세포성면역반응 을 촉발하여 침입한 병원성 미생물들을 치사케 한다(Carl sson et al., 1998; Michel et al., 2001; Charles and Killian,2015;).

비록 본 연구에서는 많은 비용과 시간이 필요로 하는 크리세 오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액에 존재하는 수 천종 이상의 분비물질들을 일일이 조사하지 못 하였으나 병원균인 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media)에 존재하는 분비물질 들과 분명한 차이가 있음을 추측 할 수 있었다. 이러한 차이가 흰점박이꽃무지(P. brevitarsis seulensis) 유충의 생존율과 면역 반응에 영향을 주는 것으로 유추 할 수 있었다.

미생물 배양액 주입에 따른 혈구세포 리소좀(Lysosome) 활성화

Fig. 1B의 결과와 같이 흰점박이꽃무지(P. brevitarsis seulensis) 유충에서 발생한 멜라닌화가 면역반응과 직접 연관이 있는 것 인지를 혈구세포 면역 활성화 여부로 재확인하였다. Fig. 1의 방법과 같이 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media), 단순 배양 액(LB media), 공생균인 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액(Ch media)을 주입한 후 혈구세포를 채혈하여 세포 성면역반응 여부를 확인 하였다(Fig. 2). 본 연구자들은 이전 연 구에서 흰점박이꽃무지(P. brevitarsis seulensis) 유충 내 존재 하는 혈구세포의 종류 및 특성에 대하여 자세히 보고 하였다 (Kwon et al., 2014; Lee et al., 2016; Cho, 2016). 특히, 면역담 당세포인 과립혈구세포(Granulocytes)는 외래물질을 인지하 고 식균작용(Phagocytosis)을 통하여 병원균을 제거하는 주요 면역세포 이며 이때 과립혈구세포질 내 리소좀(Lysosomes)이 매우 활성화 되는 것을 보고 한 바 있다(Kwon et al., 2014; Hwang et al., 2015). 그러므로 배양액들이 주입된 유충들 과립 혈구세포질 내 리소좀 활성화 여부가 세포성면역반응 지표로 활용하여 확인 하였다. 주입 1시간 후 모든 그룹에서 과립혈구 세포 리소좀의 활성화는 관찰 되지 않았다(Fig. 2A-C). 그러나 주입 12시간 이후 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media) 주입 곤충 그룹에서만 리소좀이 활성화 되는 것을 관찰 하였다(Fig. 2C-1). 주입 48시간이 지나면서 대장균(E. coli K-12) 배양액 (Ec media) 유충은 리소좀의 활성화가 점차 줄어드는 것을 확 인 하였고 이는 병원성 물질들이 리소좀에 의하여 제거가 완료 되는 것으로 추측 할 수 있었다(Fig. 2C-2). 단순 배양액(LB media)이나 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액 (Ch media)의 경우에서는 관찰 시작과 관찰 끝(48시간)까지 과 립혈구세포 리소좀의 활성화는 관찰 되지 않았다(Fig. 2A-1, A-2, B-1, and B-2).

일반적으로 면역세포들은 외래물질을 인지 후 다양한 반응 단백질(대표적으로 항생/항균 단백질)을 발현하고 동시에 외 래물질을 인지하여 식균작용을 통하여 외래물질을 제거한다. 특히, 식균작용을 통하여 세포질내로 들어온 외래물질들은 활 성화된 리소좀과 결합하여 리소좀내 다양한 효소들에 의하여 외래물질이 제거된다. 따라서 병원균인 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media) 내에는 곤충면역을 활성화 시키는 물질들이 다량으로 존재하고 이들을 제거하기 위하여 과립혈구세포의 리소좀 활성화가 관찰 된 것으로 추정 할 수 있었다. 반대로 공 생균인 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액(Ch media)에는 기주의 면역을 활성화 시키는 물질이 없거나 매우 적게 존재하는 것으로 추정 할 수 있었다.

미생물 배양액 주입에 따른 유세포분석

현미경 관찰 결과들의 신뢰도를 높이고 리소좀의 활성화를 정량적으로 측정하기 위하여 유세포분석기(Flowcytometry)를 통하여 분석하였다. 유충 한 마리당 10,000개의 혈구세포를 읽 고 염색되는 혈구세포수를 측정한 후 통계분석을 실시하였다. 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media), 단순 배양액(LB media), 공생균인 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액(Ch media)을 주입한 후 혈구세포를 채혈하여 활성화 되는 리소좀 에 대하여 유세포분석을 수행하였다(Fig. 3A-D).

대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media)의 경우 주입 ~1시간 후 혈구세포의 리소좀 활성화는 7.36%로 관찰되었다(Fig. 3C). 주입 12시간 후 53.09%로 강하게 활성화 되는 것을 알 수 있었 다(Fig. 3C-1). 24시간 후 46.49%로 리소좀의 활성화가 지속적 으로 유지되었고(Fig. 3C-2), 48시간 후 염색량 6.80%로 다시 감소하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 3C-3). 그러나 단순 배양 액(LB media) 주입 유충들은 평균적으로 0.9% (Fig. 3A - A-3), 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액(Ch media) 주입 유충들의 경우도 주입 12시간 후 최대 4.78%만 염색되는 것을 알 수 있었다(Fig. 3B - B-3). Fig. 3D는 그룹 별(유충 10마 리 씩) 유세포 분석 3반복 결과를 나타내며 대장균(E. coli K-12) 배양액(Ec media) 주입 유충들에서만 리소좀 활성화가 1시간 이후부터 차츰 증가하여 12시간에 최대로 나타나고 시간의 흐 름에 따라 차츰 감소되는 것을 알 수 있었다(Fig. 3D). 이는 ~12 시간 내 식균작용에 따른 리소좀이 빠르게 활성화 되고 병원균 의 원인 물질들을 제거 한 후 시간이 흐르면서 원래 상태로 복귀 되는 것으로 판단 할 수 있었다. 그러나 단순 배양액(LB media), 크리세오박테리움(Chryseobacterium sp.) 배양액(Ch media) 주입 유충들의 경우는 배양액내 병원균의 원인 물질들이 없거 나 또는 량이 매우 적게 존재하여 리소좀의 활성화가 관찰 되지 않았던 것으로 판단 할 수 있었다.

위의 결과들은 병원성 미생물들이 성장하면서 배출하는 다 양한 분비물질(Metabolites)들이 곤충에서는 면역 촉발 인자로 사용되고 있음을 나타낸다. 앞으로 공생균인 크리세오박테리 움(Chryseobacterium sp.) 배양액(Ch media)내 존재하는 수 천 종 이상의 분비물질들 분석을 통하여 각각의 곤충 면역촉발 인 자를 정확히 특정 한다면 원인 물질들에 의한 체계적인 곤충 면 역 신호전달 연구, 미생물 감염 없이 면역 활성화, 면역 억제, 질 병예방, 치료 등 다양한 병리학 분야에도 적용이 가능 할 것으 로 판단한다.