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풀무치는 아프리카에서 기원해서 남북아메리카대륙과 양극 지방을 제외한 유럽, 아시아, 오스크레일리아와 뉴질랜드에서 분포를 하는 해충이다(Chapuis et al., 2008; Chen et al., 1999; Ma et al., 2012). 풀무치는 대량발생을 하면 먹이를 찾아서 이 동을 하는데, 이동 경로에 존재하는 농작물을 포함한 모든 식물 체에 심각한 피해를 준다. 최근에는 유럽에서 대량발생은 보고 되지 않지만, 아프리카, 오스트레일리아, 뉴질랜드, 중앙 아시 아, 중국과 일본에서 대량발생이 보고되고 있다(Ernst et al., 2015; Yamagishi and Tanake, 2009). 식생에 심각한 피해를 주 는 중요한 해충이기에 풀무치에 대한 다양한 연구가 이루어 졌 다. 그 중에 풀무치의 발생에 관련된 연구의 결과들은 풀무치의 발육속도는 온도와 높은 상관관계가 있음을 보여주고 있다(Tu et al., 2012; Tu et al., 2014). 연구결과에 따르면, 고온의 열대 지방에서는 일 년에 여러 세대가 발생을 할 수 있다. 하지만, 온 대지방에서는 초여름 알에서 깨어나 여름에 성충으로 변태를 완성한 후, 일장이 짧아지고 기온이 낮아지는 가을에 월동을 할 수 있는 알을 땅속에 산란한다. 그리고 성충은 월동을 하지 못 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 온도와 연관성이 있는 풀무치의 발육속도는 현재 진행되고 있는 지구 온난화와 상호작용을 하 여 온대지방에서도 대량발생 하는 주요 해충이 될 가능성을 보 여준다.
전 지구적인 기후변화가 농업에 가져오는 커다란 문제점 중 의 하나는 과거에는 문제를 일으키지 않던 곤충들이 서식 환경 의 변화와 해충의 생리 변화가 상호 상승 작용을 하여 해충화 되는 것이다(Bebber et al., 2013; Chen et al., 2011; Cornelissen, 2011). 그러한 예 중의 하나가 풀무치로서 2014년 8월에 대한 민국 해남군 산이면 친환경 간척지에서 대량발생이 국내 최초 로 발견 되었다(Kim et al., 2014; Jung et al., 2017; Kim et al., 2016; Lee et al., 2016). 최근 3년간 풀무치에 대한 전국적인 채 집을 진행한 결과, 도서지역을 포함한 한반도의 거의 전역에 분 포함을 알 수 있었다. 풀무치의 발생 밀도가 타 지역보다 높은 지역은 전라남도의 해남군 산이면 덕호리 간척지 와 무안군 망 운면 피서리 간척지로, 7월부터 성충의 발생이 관찰이 되었다 (Jung et al., 2017; Kim et al., 2016). 하지만, 다른 지역의 경우 는 풀무치 개체군의 밀도가 높지 않았다. 두 지역의 가지는 공 통점은 간척지로서 넓은 면적의 사료작물들이 친환경적으로 재배가 되고 있고, 간척지의 일부분이 경작이 되지 않고 방치되 어 다양한 식물상이 존재를 하여, 비행능력이 뛰어난 풀무치 성 충은 그 곳으로 도피를 할 수 있는 은신처를 가지고 있다는 공 통점이 있다(Kim et al., 2016). 최근에 우리는 마이토콘드리아 의 cytochorom c oxidase subunit I의 염기서열(Lee et al., 2016) 과 16S ribosomal RNA 와 displacement-loop (D-loop) 유전자 서열을 이용한 계통분석 결과(Kim et al., 2016), 해남의 풀무치 가 북방계열일 가능성을 보고 하였다. 하지만, 아직까지 무안군 풀무치의 기원에 대한 연구는 진행이 이루어 지지 않았다. 무안 군 망운면 간척지는 1960년대에 간척을 시작을 하여1980년대 에 완공이 되었고(http://www.muannews.com/news/articlePrint. html?idxno=9930), 해남군 산이면 간척지는 1985년에 간척을 시작하여 2004년도에 완공이 된 신규 간척지(http://estate.mk. co.kr/news2011/view.php?sc=&year=2009&no=494873) 라는 시기적인 차이점이 있다. 직선거리는 33 km로 지리적으로 가 깝지만, 영산강과 영암호가 사이에 자리잡고 있어서 지리적으 로 서로 격리되었을 가능성이 크다. 그리고, 현재까지 무안군 망운면 간척지에서 대량발생이 일어났다는 보고는 없다. 해남 풀무치와 무안풀무치의 머리에 발현되는 micro-RNA들에도 차이가 있음을 우리는 보고 하였다(Jung et al., 2017). 그러므 로, 우리는 두 지역에서 채집된 풀무치들의 기원이 다를 것이라 는 가설을 세우고 기원을 밝혀내는 연구를 진행하기 위하여 마 이토콘드리아에 존재하는 NADH dehydrogenase subunit중에 서 3개의 염기서열을 밝혀낸 후에 다른 기존에 발표된 서열들 과 비교하여 기원을 밝혀내는 연구를 진행하였다.
재료 및 방법
풀무치채집
2016년 9월에 전라남도 해남군 산이면 덕호리 간척지와 무 안군 망운면 피서리 간척지에서 풀무치(Locusta migratoria)를 채집하였다.
마이토콘드리아 DNA 추출 방법 및 염기서열 분석법
마이토콘드리아 DNA를 포함한 전체 유전체 DNA는 Qiagen DNeasy Blood & Tissue genomic DNA extraction kit (Qiagen, Venlo, Netherlands)를 이용하여 추출을 하였다. 풀무치의 다리 를 절단 한 후에 조직 용해 용액을 넣고 균질화를 시킨 후, protein K를 첨가하여 56℃에서 10분간 보관을 하여 단백질들을 분해 한다. 동일한 튜브에 absolute ethanol (Daejung Chemical & Metals Co. Seoul, Korea)을 첨가한 후, vortex mixer로 15초간 썩어 준 후, 상온에서 8,000 rpm에서 원심분리를 1분간 수행한 후, 상등액을 분리해 낸다. 분리된 상등액은 DNA결합 컬럼으 로 옮긴 후 14,000 rpm에서3분간 원심분리를 진행한다. DNA 겹합 컬럼을 새로운 튜브로 옮긴 후에 100◑l의 용출용액을 이 용하여 genomic DNA와 mitochondrial DNA를 추출한다.
마이토콘드리아 NADH dehyhdrogenase subunit (NAD) 2, NAD4와 NAD5를 PCR로 증폭을 하였다. PCR에 사용된 primer 의 서열은 Table 1에 있다. 증폭된 PCR산물은 pGEMT-easy TA cloning kit (Promega, Fitchburg, WI, USA)로 cloning을 했 다. 목표 DNA를 포함하고 있는 plasmid를 가지는 E. coli를 액 체배지로 배양하여 plasmid minipreo kit (Qiagen)을 이용하여 정제를 하였다. 정제된 plasmid의 양쪽 DNA에 대한 capillary sequencing 을 수행하여 3개의 NAD의 서열을 확인하였다. 밝 혀진 염기서열은 CLC sequence viewer 7.7 (Qiagen)을 이용하 여 분석을 진행하였다. 각각 3개체의 genomic DNA를 이용하 여 반복 실험을 수행하였다. 반복 간에 유전자 서열의 차이는 존재를 하지 않았다.
해남과 무안 풀무치의 NAD2와 NAD5을 이용한 phylogenetic analysis
본 연구에서 밝혀낸 해남과 무안의 풀무치의 2개의 NAD의 서열을 이용하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI) nucleotide BLAST를 수행하였다. 그 결과 total score가 높은 NAD2 와 NAD5의 DNA서열들을 풀무치 전체 마이토콘 드리아 서열에서 얻어낸 후, CLC sequence viewer 7.7 (Qiagen) 을 이용하여 비교분석을 수행하였다. 다른 종과의 Phylogenetic 연관성 분석을 수행하기 위하여 Oedaleus decorus asiaticus 와 Oedaleus infernalis Saussure (팥중이)의 NAD2와 NAD5의 서 열을 out-group으로 이용하여 분석을 진행하였다. Phylogenetic tree는 Neighbor Joining방법으로 제작하였다. 염기서열 간의 거리는 Jukes-Cantor방법으로 수행을 하였고, Bootstrapping분 석은 1,000반복 수행하였다. 결과는 phylogram으로 나타냈고 Bootstrap의 수치를 각각의 분지 점에 표시를 하였다.
결 과
해남풀무치와 무안풀무치의 NAD2와 NAD5의 경우 염기 서열에 차이가 있음
본 연구에서 해독한 해남풀무치와 무안 풀무치의 마이토콘 드리아의 NAD2와 NAD5의 서열을 비교 분석하였다. 그 결과 우리는 NAD2의 경우는 염기서열 1개가(Fig. 1A), NAD5의 경 우는 5개가(Fig. 1B~G) 해남과 무안에서 차이가 있음을 밝혀 냈다. 하지만, NAD4의 경우에는 해남 풀무치와 무안 풀무치에 서 차이가 존재를 하지 않았다(KYH and KYH, data not shown). 그러므로, NAD4는 풀무치의 기원을 밝혀내는데 사용을 하지 않았다.
해남풀무치는 중국 풀무치 계통과 무안풀무치는 일본 풀무치 계통과 가장 가까웠음
본 연구에서 밝혀낸 해남풀무치와 무안풀무치의 NAD2와 NAD5의 염기서열을 이용하여 이들의 기원에 관한 연구를 진 행하였다. 우선 해남풀무치와 무안풀무치의 NAD2와 NAD5의 염기서열을 이용하여 NCBI에서 BLAST를 수행하여 가장 높 은 상동성을 보이는 NAD2와 NAD5의 서열을 각각 13개씩 확 보하였다. 확보한 염기서열을 이용하여 계통학적인 분석을 수 행하였다. 그 결과 해남풀무치의 NAD2는 중국의 Liaoning성 (JN858152.1) 과 Jiangsu 성(JN858158.1)에서 채집된 풀무치 와 근연 관계가 가장 높게 나타났다. 그리고 무안풀무치의 NAD2의 경우는 일본풀무치(JN858148.1)와 가장 근연 관계가 높았다(Fig. 2).
우리는 해남풀무치와 무안풀무치의 기원을 더욱 정확하게 분석을 하기 위하여 NAD5 유전자의 염기서열을 이용하여 추 가로 분석을 수행하였다. 그 결과, 해남 풀무치의 경우는 중국 의 북동쪽 러시아 접경 지역에 위치한 Heilongjiang 성 에서 채 집된 풀무치(JN858151.1)와 가장 기원이 비슷하였고, 그 다음 으로는 Jiangsu성 에서 채집된 풀무치(JN858163.1)와 비슷하 다는 결과가 나왔다(Fig. 3). 그리고 무안계통의 경우는 일본풀 무치(JN858148.1)와 가장 비슷하다는 분석이 나왔다(Fig. 3). 이러한 NAD5와 NAD2의 분석결과는 해남풀무치와 무안풀무 치가 각각 다른 시기에 다른 경로로 이주를 해왔을 가능성을 제 기 하고 있다.
고 찰
2014년도의 전라남도 해남군 산이면 덕호리 간척지에서의 풀무치의 대량발생은 기후변화와 곤충의 생리 변화가 어떻게 상승작용을 가져오는지를 보여주는 중요한 예이다. 전 지구적 인 온난화로 연 평균기온이 지속적으로 상승하고 있다. 이러한 연 평균 기온의 상승, 특히 겨울철 평균기온의 상승은 새로운 해충의 출현을 가져올 수 있다(Bebber et al., 2013; Chen et al., 2011; Cornelissen, 2011). 하나의 예는 이전에는 겨울철 기온 이 낮아서 월동을 하지 못했던 비례 해충들이 월동이 가능 하게 되면서 도착 해충화 될 수 있다. 두 번째 예는 약제 저항성 해충 들의 경우 겨울철 저온에 민감하여 월동 후 생존하는 개체 수가 적은데, 겨울철 온도의 상승은 월동 후 생존하는 저항성 해충의 수를 급격하게 증가 시킬 수 있다. 그러므로, 다음 해에 약제 저 항성을 획득한 개체군의 수가 급격히 증가를 할 수 있다. 마지 막으로, 이전에는 문제가 없던 곤충들이 평균 기온의 상승으로 생육가능기간이 길어지고 동시에 발육속도가 빨려져 대량으로 발생할 수 있는 조건이 되므로 해충화 되는 것이다.
풀무치는 뛰어난 환경 적응성 때문에 전 세계에서 가장 넓게 분포하는 해충 중의 하나로서, 아프리카와 아시아와 오세아니 아 대륙에서 심각한 작물에 대한 피해를 끼치고 있다(Ma et al., 2012; Ernst et al., 2015; Yamagishi and Tanake, 2009). 하지만, 대한민국에서는 2014년 대량발생 이전에는 풀무치에 의한 작 물 피해는 보고된 바 없다. 이러한 대량발생의 원인을 구명하는 연구의 일환으로 전국에서 풀무치의 서식 밀도가 높아 향 후 대 량발생의 가능성이 높은 전라남도 해남군 산이면과 무안군 망 운면 간척지역 서식하는 풀무치들에 대한 비교 연구를 진행을 하였다. 풀무치의 계통분석연구에는 NAD들의 염기서열을 사용 한다는 보고가 있어서(Ma et al., 2012; Sorenson and Franzosa, 2007), 우리는 풀무치의 마이토콘드리아에 존재하는 3개의 NAD에 대한 분석을 진행하였다. 그 결과, NAD4의 경우 두 개 체군에서 염기서열의 차이가 없었다. 그러나 NAD2와 NAD5의 경우는 염기서열의 차이가 있어서, 이들을 이용한 비교 연구를 진행하였다(Fig. 1). 우리는 이전의 해남풀무치의 계통분석연 구에서 이들이 북방계통에 속한다는 것을 보고 하였다(Kim et al., 2016; Lee et al., 2016). 본 연구의 결과도 동일하게 해남풀 무치와 무안풀무치는 북방계통에 속하는데 이들과 가장 비슷 한 기원을 가지는 풀무치들은 해남의 경우는 중국 동부해안의 Jiangsu성 개체군이나 동북부의 Liaoning성 과 Heilongjiang성 개체군과 기원이 비슷하고, 무안계통의 경우는 일본개체군과 비슷하다는 결론에 도달 했다(Figs. 2, 3). Ma et al. (2012) 는 북 방 풀무치 계통이8만 년 전에 중국의 동북부 지방에서 분리되 어져서 일부는 중국내륙으로 이동을 하고 일부는 러시아의 사 할린과 일본의 홋카이도 섬을 거쳐서 일본으로 이동을 했을 가 능성이 있다고 발표를 하였다. Ma et al. (2012)의 논문에서는 한국의 풀무치에 대한 분석 연구가 이루어 지지 않았지만, 우리 의 결과는 Liaoning성 과 Heilongjiang성 개체군들이 8만 년 전 에 중국 동북부 지역에서 분리되어져 일부는 한반도로 이주를 시작하여 해남지역에 정착을 하고, 일부는 Ma et al. (2012)의 제안처럼, 러시아의 사할린과 일본의 홋카이도 섬을 거쳐서 일 본으로 이주를 하여 정착을 한 후, 한반도 무안지역으로 이동을 하였을 가능성이 있다. 하지만, 일본풀무치 개체군도 러시아의 사할린과 일본의 홋카이도 섬을 거치지 않고, 한국의 무안지방 을 거쳐서 일본으로 이동을 하여 정착을 하였을 가능성도 배제할 수 는 없다. 하지만, 두 가지의 가설 중 어느 경우도 해남풀무치 와 무안풀무치 계통은 오래 전에 나뉘어 졌음을 시사하고 있다.
마지막으로 무안풀무치 개체군이 대량발생을 하지 않는 이 유는 유전적인 차이점 이외에도 간척지 면적의 차이에 의할 수 도 있다. 해남 간척지의 크기는 무안 간척지 보다 수십 배 넓으 므로, 풀무치 개체군이 커지면서 군집화 될 가능성이 매우 높다 고 하겠다. 그러므로, 향 후 풀무치의 대량발생에 의한 피해를 방지하기 위해서는 한반도 전 지역에 분포하는 풀무치 개체군 에 대한 지속적인 발생 예찰과 기원에 대한 연구를 진행이 필요 하다.
KSAE
