복숭아순나방(Grapholita molesta)은 중국 북서부 지역에서 유래된 것으로 추정되며(Hallman, 2004) 현재는 전 세계 거의 모든 온대 지역에 분포하며 사과를 비롯한 배, 복숭아 등의 과 실류와 함께 장미과 식물 등에도 심각한 피해를 주고 있다 (Rothschild and Vicker, 1991; Knight et al., 2014). 특별히 과 실 내부를 가해하여 이들 농작물의 일차피해를 주게 된다. 이러 한 과실 내부의 섭식 행동은 살충제 살포에 따른 접촉을 어렵게 하여 약제 방제에 어려움을 주게 된다. 따라서 이 해충의 방제 는 과실 밖에서 활동하는 시기인 성충태가 주목 받게 된다.

복숭아순나방의 교미신호는 성페로몬에 의존하며, 하루 중 일정한 시각에 수컷은 성페로몬 신호에 유인된다(Kim et al., 2011). 복숭아순나방의 성페로몬은 Z-8-dodecenyl acetate (Z8- 12:Ac)와 E-8-dodecenyl acetate (E8-12:Ac) 및 Z-8-dodecenol (Z8-12:OH)를 가지며 95:5:1의 조성을 가진다(Han et al., 2001; Yang et al., 2002). 이들 성페로몬의 생합성 과정을 밝히기 위 해 성페로몬 샘의 전사체가 RNA-Seq 기술로 분석되었다(Jung and Kim, 2014). 성페로몬 샘 전사체는 지방산 생합성에 관여 하는 효소들의 전사체를 포함하고 있었으며, 이를 통해 복숭아 순나방 성페로몬이 스테아릭산(stearic acid) 또는 팔미틱산 (palmitic acid)과 같은 포화지방산 전구체에서 β-산화를 통해 사슬 길이를 줄이고 다시 이중결합 형성, 환원반응 및 아세틸화 를 통해 생합성되는 것으로 추정하였다(Jung and Kim, 2014). 특히 포화지방산 전구체에서 10번 탄소에 이중결합을 주는 불 포화효소(Δ10 DES)의 활성이 궁극적으로 종 특이적 성페로몬 생합성에 결정적 역할을 담당한다는 것을 제시하였다(Jung and Kim, 2014). 이러한 전사체 연구를 통해 다양한 불포화효 소 유전자를 보고하였으며, 이 가운데 Gm-comp1575 전사체가 Δ10 DES의 후보로 추정하였으나, 성페로몬 생합성에 연관된 기능 연구는 진행되지 않았다.

본 연구는 Gm-comp1575 유전자에 대해서 분자구조 및 기 능 연구를 통해 복숭아순나방 성페로몬 생합성에 관여하는 지 를 밝히는 목적을 두었다. 아울러 RNA 간섭 기술을 통한 성페 로몬 생합성 억제 효과를 바탕으로 본 연구는 향후 복숭아순나 방의 새로운 교미교란 기술을 제시하려 한다.

재료 및 방법

복숭아순나방 사육

안동지역 사과밭에서 채집한 유충을 실내에서 3년 이상 사 과를 먹이로 누대 사육하였다. 실내 사육 조건은 온도 25±2℃, 상대습도 60±20%, 광주기 16:8 h (명:암)이었다. 성충의 먹이 는 5% 꿀물을 공급하였다. 성충의 산란은 기주 사과 또는 매끄 러운 아크릴판을 이용하여 유도하였으며, 부화하는 유충은 사 과로 유인하여 수거하고 차세대 사육에 이용하였다.

Gm-comp1575 유전자 서열 분석

Gm-comp1575는 복숭아순나방 전사체(GenBank accession number: PRJNA194591)로 부터 염기서열을 얻었다. 염기서열 을 바탕으로 Lasergene (DNASTAR, Madison, WI, USA)의 EditSeq 프로그램을 이용하여 open reading frame의 아미노산 서열을 추정하였다. 추정된 아미노산 서열은 ExPASy (www. expasy.org)의 단백질체 분석용 프로그램을 이용하여 생체막 투과영역 및 N/O-glycosylation 위치를 추정하였다.

RNA 추출 및 cDNA 제조

복숭아순나방의 발육시기별(유충, 번데기 및 성충) 그리고 암컷 성충 복부 부위별 총 RNA를 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA (반응 당 1 μg) 는 RT-PREMIX (Intronbio, Seoul, Korea)를 이용하여 cDNA 를 제조하였다.

RNA 간섭

RNA 간섭은 이중나선형 RNA (dsRNA)을 이용하였다. Gmcomp1575 유전자에 특이적 양쪽 프라이머 5' 말단에 T7 프로 모터 서열을 연장하여 제조한 프라이머(5'-TAATACGACTCA CTATAGGGCAGCATTCTGCTTCGTGTTG-3', 5'-TAATAC GACTCACTATAGGGGGGAATGTGTGGTGGTAGTT-3') 를 이용하여 247 bp 크기의 PCR 결과물을 얻었다. 이때 PCR 반응은 복숭아순나방 암컷 cDNA를 주형으로 94℃에서 1분간 변성조건, 50℃에서 1분간 프라이머 결합조건 그리고 72℃에 서 1분간 사슬연장 조건을 35회 반복하여 이뤄졌다. 얻어진 PCR 결과물을 10배 희석하여 Megascript RNAi 키트(Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하여 37℃에서 3시간 반응하여 dsRNA 를 제조하였다. 포함된 주형 DNA와 단일사슬형 RNA를 제거 하고, 순수한 dsRNA는 GeneQuant 분광광도계(Amersham, Science Park, Singapore)를 이용하여 정량화하였다. dsRNA 를 대상 곤충에 주입하기 전에 동일 부피의 Metafectene Pro (Biontex, Plannegg, Germany)를 혼합하여 리포좀을 형성하게 하였다. 이 리포좀 1 μL (300 ng dsRNA)를 복숭아순나방 번데 기에 주입하였다. 주입될 번데기는 우화 1일전의 발육시기로 서 황색으로 발달된 날개의 모습과 흑색의 겹눈 형태로 판단하 였다. dsRNA의 미량주입은 미량주입장치(PV830 Pneumatic Pico Pump, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) 를 이용하였다. 대조구 RNA 간섭 처리는 바이러스 유전자의 dsRNA (Park and Kim, 2010)를 이용하였다.

RT-PCR과 RT-qPCR

복숭아순나방 발육시기별 그리고 조직별 cDNA를 이용하 여 Gm-comp1575 유전자의 특이적 프라이머(5'-CCGGTATT GGTGTCATCGCTCCTA-3', 5'-CGACAGACACGCCCCAG TTTTCAA-3')로 RT-PCR을 진행하였다. 반응조건은 2분간 94℃에서 초기 변성반응 후 35회 증폭반응을 실시하였다. 증폭 반응의 각 주기는 94℃에서 1분, 50℃에서 1분 그리고 72℃에 서 1분의 연속반응으로 구성되었다. RT-qPCR은 SYBR Green Realtime PCR master mixture (Toyobo, Osaka, Japan)를 반응 용액으로 7500 real time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 기기를 이용하였다. 반응용액(20 μL) 은 각 프라이머 5 pmol 씩 그리고 50 ng의 주형 cDNA루 구성 되었다. 초기 94℃에서 15분간 활성 반응 이후에 45회 증폭반 응을 실시하였다. 증폭반응의 각 주기는 94℃에서 30초, 50℃ 에서 30초 그리고 72℃에서 1분의 연속반응으로 구성되었다. 매 주기 증폭물의 형광도를 측정하였고, 반응 후 생성물의 융점 을 분석하여 단일 생성물을 확인하였다. 상대 임계증폭주기 횟 수(critical threshold: CT) 방법(Livak and Schmittgen, 2001)을 이용하여 전사체의 상대 량을 산출하였다. 내재하는 항시발현 유전자 대조구로서 라이보좀 단백질 유전자인 RL32 (5'-ATG CCCAACATGGTTACGG-3', 5'-TTCGTTCTCCTGGCTGCG GA-3')의 증폭량을 이용하여 분석될 시료들의 상대 RNA 추출 량을 보정하였다.

야외 유인력 검정

안동시 남선면에 소재하는 사과밭에서 RNA 간섭으로 Gmcomp1575 유전자의 발현이 억제된 복숭아순나방 처녀암컷의 수컷 유인 능력을 2회(2016년 7월 1-7월 8일, 7월 22일-8월 1 일) 실시되었다. 갓 우화한 암컷 성충을 구형의 찻망(직경 5 cm) 에 설탕물과 함께 넣고, 델타트랩(그린아그로텍, 경산, 한국)에 설치하였다(Fig. 5A 참조). 대조구 암컷은 위에서 기술한 비특 이적 바이러스 dsRNA를 처리한 개체를 이용하였다. 전체 5반 복이 실시되었다.

결 과

Gm-comp1575 추정 단백질 특징

복숭아순나방 성페로몬 샘의 전사체(Jung and Kim, 2014) 를 토대로 이 곤충의 성페로몬 생합성에 관여하는 불포화효소 가 미리스틱산(myristic acid)의 10번 탄소에서 불포화를 만드 는 Δ10 DES로 추정하였고, 이러한 분석과정에서 복숭아순나 방 전사체 가운데 Gm-comp1575 유전자 발현체가 이 불포화효 소 서열과 유사성이 있다고 제시하였다. 본 연구에서는 이 유전 자의 아미노산 서열을 토대로 기존에 알려진 불포화효소들과 분자계통학적 분석을 실시하였다(Fig. 1). 성페로몬에 발현되 고 성페로몬 생합성에 관여하는 곤충 불포화효소들은 Δ9 DES, Δ10 DES 그리고 Δ11 DES로 분지하였다. 이 가운데 본 연구에 서 분석하는 Gm-comp1575는 이들 가지에 속하지 않고 단독으 로 분지되었다. 특별히 유사종인 복숭아순나방붙이의 Gd-comp 305와 함께 분지되어 있었다. 이는 Jung and Kim (2014)이 분 석한 분자계통수에서 Δ10 DES와 함께 분지되는 것과는 차이 를 보이고 있다. 그러나 Gm-comp1575는 이들 DES 분지들의 관계에서 Δ10 DES와 가깝게 위치하는 것은 확인할 수 있었다.

Gm-comp1575의 단백질 구조를 분석하여 이 유전자가 기존 에 알려진 불포화효소 단백질과 유사한 기능 영역을 갖고 있는 지를 분석하였다(Fig. 2). Gm-comp1575 단백질의 전체 아미노 산 개수는 370개이고 시그날펩타이드는 추정되지 않았다. 이 를 토대로 추정한 분자량은 약 43.2 kDa 그리고 등전점(pI)은 8.77로 염기성 단백질로 나타났다. 기존 연구에서(Jung and Kim, 2014) 3개의 histidine 보존영역을 보고하였다. 본 연구는 추가하여 총 4개의 막투과영역을 검출하였고, 이를 토대로 N 말단과 C 말단 부위는 세포 밖으로 위치하는 배열을 추정하였 다. N-glycosylation은 3개가 추정되었고 이 가운데 2개는 N-말 단 세포밖 부위이고, 나머지 하나는 세포내 연결 고리에 위치하 였다. O-glycosylation도 3개가 추정되었고 유사하게 2개는 N 말단 부위 그리고 나머지 하나는 세포내 연결 고리에 자리하는 것으로 추정되었다.

Gm-comp1575 유전자 발현 양상

복숭아순나방 성페로몬 샘 전사체에서 얻어진 Gm-comp1575 유전자가 발육시기와 암컷 성충의 조직 부위에서 어떠한 특이 적 발현을 하는 지를 RT-PCR로 분석하였다(Fig. 3). 이 유전자 는 유충 말기에 발현되기 시작하여 성충시기에 암수 모두 발현 되는 것을 확인하였다(Fig. 3A). 특히 암컷의 경우 머리, 가슴, 배 부위로 나누어 RNA 추출하고 여기서 얻은 cDNA로 발현을 조사한 결과 배 부위에서만 발현하는 것으로 나타났다(Fig. 3B). 복부 내에서 성페로몬 샘과 이 페로몬 샘이 빠진 복부로 나 누어 분석한 결과 두 부위 모두에서 발현되는 결과를 나타냈다. 이러한 결과는 Gm-comp1575가 암컷의 성페로몬 샘뿐만 아니 라 다른 복부 조직에서도 발현하는 것으로 확인되었다.

Gm-comp1575 유전자의 RNA 간섭 효과

Gm-comp1575의 단백질 구조 및 이 유전자의 성페로몬 샘 발현은 이 유전자가 성페로몬 생합성과 관련이 있을 것으로 추 정되었다. 이를 확인하기 위해 RNA 간섭 기술로 Gm-comp1575 의 기능을 분석하였다. RNA 간섭을 위해 본 연구는 Gm-comp 1575 유전자의 특이적 dsRNA를 제조하였다. 이를 복숭아순나 방 번데기에 주입하고 시간별로 발현되는 Gm-comp1575의 전 사체량을 RT-qPCR로 정량화하였다(Fig. 4). dsRNA를 주입받 은 복숭아순나방 암컷은 처리 후 24시간이 경과하면서 발현 량 의 감소를 보이고 이 효과는 48시간까지 지속하였다(Fig. 4A). 이 전사체량을 분석하여 보면 약 50% 감소한 것으로 나타났다 (Fig. 4B). 반면에 dsRNA 대조구 처리에서는 전사체량 감소를 나타내지 않았다.

이러한 RNA 간섭 조건에서 복숭아순나방의 수컷 유인 능력 을 야외 검증으로 실시되었다(Fig. 5). 갓 우화한 복숭아순나방 암컷을 망사 통에 가두고 모니터링에 사용되는 델타트랩에 설 치한 후 이를 사과원에서 유인효과를 검증하였다(Fig. 5A). 조 사 시기는 복숭아순나방의 발생이 있는 7월말에 실시되었다. 각 처리는 1주간 포획 수컷 밀도로 산출한 결과 RNA 간섭을 받 은 처리구는 대조구에 비해 현격하게(F = 6.34; df = 1,8; P = 0.0359) 낮은 포획능력을 나타냈다(Fig. 5B).

고 찰

나비목 곤충 가운데 95% 이상이 휘발성 성페로몬을 이용하 여 교미 통신을 수행하게 된다(Scoble, 1992; Grimaldi and Engel, 2005). 이 가운데 대부분의 나비목 종들이 포함된 이문 나방아목(Ditrysia)은 지방산에서 유래된 성페로몬 성분을 이 용하고 있다(Roelofs, 1995; El-Sayed, 2007). 그러나 성페로몬 의 기능을 발휘하기 위해서는 휘발성을 가져야하기에 지방산 의 탄소수가 12-18개로 제약이 되며, 다양한 나비목 종류에 비 춰 성페로몬 신호의 다양성을 추구하기 위해 상이한 광학이성 체의 이중결합 추가 및 관능기의 분화(알코올, 알데하이드 및 아세테이트)를 보이게 된다(Liénard et al., 2008). 이러한 성페 로몬은 이들 나비목 곤충의 경우 복부 8번째와 9번째 마디 사이 의 표피세포층이 분화된 성페로몬 샘에서 생합성되어 방출되 게 된다(Percy-Cunningham and MacDonald, 1987). 잎말이나 방과(Tortricidae)에 속한 복숭아순나방의 경우도 성페로몬 성 분은 지방산 유도체이고 이 가운데 두 주요 성분인 Z8-12:Ac 와 E8-12:Ac의 상호 비율은 근연종인 복숭아순나방붙이(G. dimorpha)와의 생식적 격리를 유도하는 데 주요하다(Jung et al., 2012). 복숭아순나방의 경우 복숭아순나방붙이에 비해 높 은 cis 비율 혼합체에 유인되었다. 따라서 이 이중결합을 형성 하는 불포화효소의 촉매 능력의 차이가 이 두 종의 종분화에 결 정적 역할을 하였을 것으로 추정하였다(Jung and Kim, 2014).

지방산 불포화효소는 사슬형 탄화수소에 이중결합을 형성하 는 반응을 촉매하며 이때 이중결합은 위치와 광학이성체에서 특 이성을 갖는다. 이 불포화효소는 분자계통학적으로 상이한 두 부류로 나뉘어 한 형태는 생체막에 결합형과 사슬형 탄화수소 운 반형으로 분류된다(Sperling et al., 2003). 운반형 불포화효소 는 주로 식물체에서 나타나는 형태로 스테아릭산(stearic acid) 을 올레익산(oleic acid)로 전환하는 기능을 담당한다(Kachroo et al., 2007). 대부분의 불포화효소는 생체막 결합형으로 전형적 인 histidine box 보존서열을 3개 갖는다(Shanklin et al., 1994). 본 연구에서 분석된 Gm-comp1575는 3개의 histidine box 보존 서열을 갖으며, 4개의 생체막 투과영역을 갖는 것으로 아미노 산 서열 분석은 보여주었다. 따라서 Gm-comp1575는 전형적 생체막 결합형 불포화효소로 간주된다. Hashimoto et al. (2008) 은 56 종의 진핵생명체에 존재하는 275개의 불포화효소 아미 노산 서열을 분석한 결과 First Desaturase, Omega Desaturase, Front-End Desaturase 및 Sphingolipid Desaturase로 크게 4 종 류로 구분하였다. First Desaturase는 많은 불포화효소를 포함 하고 주로 팔미틱산(palmitic acid) 또는 스테아릭산의 9번 탄 소에서 이중결합을 만드는 기능을 수행한다. Omega Desaturase 는 이미 이중결합을 갖는 지방산에 12번 또는 15번 탄소에 이 중결합을 추가하는 기능을 수행한다. Front-End Desaturase는 설정된 이중결합과 카르복실 말단 사이에 이중결합을 추가하 는 기능을 담당하여 주로 4, 5, 6번 탄소에 이중결합을 추가하 게 된다. Sphingolipid Desaturase는 스핑고지질의 불포화효소 이다. 이러한 부류에서 Gm-comp1575가 복숭아순나방 성페로 몬 성분이 갖는 10번 탄소 위치의 이중결합을 형성하는 데 관여 하게 된다면 First Desaturase에 속하게 된다. 특히 본 연구에서 진행한 분자계통분류 분석에서 Gm-comp1575는 Δ10 DES와 유사하게 분류되었다. 그러나 이러한 유사성이 기능을 대변하 는 것이 아니기 때문에 추가 기능 연구는 필요하다.

Gm-comp1575는 암컷 성페로몬 샘에서 발현되었다. 추가적 으로 종령 유충과 수컷 성충에서도 발현되는 것으로 나타났다. 우선 성페로몬 샘에서 Gm-comp1575가 발현되는 것은 성페로 몬 생합성에 관여할 가능성을 높여주고 있다. 포화지방산이 이 중결합형성과 관능기 치환반응을 거쳐 성페로몬으로 전환되게 하는 일반적 제1형 페로몬 생합성 경로에서 보듯이(Löfstedt et al., 2016) 이 효소가 미리스틱산을 대상으로 10번 탄소 위치에 서 cis 형의 이중결합을 형성하면 이후에 β-산화를 거쳐 탄소수 는 12개로 줄어든 라우릭산(lauric acid)로 전환되고, 자연히 이 중결합 위치는 8번째로 옮겨지게 된다. 이때 fatty acid reductase 와 acetyl transferase에 의해 아세틸기를 추가하면서 Z8-12:Ac 성분의 성페로몬이 생합성되게 된다. 유사한 Δ10 DES 활성이 두 잎말이나방류인 Ctenoseustis obliquana와 Planotortrix octo 에서 발견되었으며, Z8-14:Ac를 생합성하는 데 관여하였다 (Albre et al., 2012). 그러나 본 연구에서 보인 Gm-comp1575 유전자의 타 조직에서 발현은 이 불포화효소가 성페로몬 생합 성 이외의 기능을 가질 수 있다는 것으로 나타내고 있다. 추후 이 유전자의 추가 발현을 통한 지방산 변화 분석을 통한 기능 연구를 실시하여 정확한 반응 특이성을 분석할 필요가 있다.

Gm-comp1575 유전자의 발현 억제는 복숭아순나방 암컷의 수컷 유인력 감소를 초래하였다. 이 유전자에 특이적인 dsRNA 는 우화하기 직전의 번데기시기에 주입하여 우화한 성충에서 Gm-comp1575의 발현량 감소를 초래하였다. 유사한 잎말이나 방류인 Epiphyas postvittana에서는 유충에 dsRNA를 섭식시 킬 경우 유충 중장세포의 유전자 발현을 억제할 뿐만 아니라 성 충 촉각에서 발현하는 페로몬결합단백질 유전자에 대한 특이 적 dsRNA를 유충에 섭식시켰을 때 성충 시기에 이 유전자의 발현이 감소되는 것을 보고하였다(Turner et al., 2006). 이러한 결과는 비교적 나비목 곤충에서 RNA 간섭 효과를 기대하기 어 려운 양상(Huvenne and Smagghe, 2010)과는 달리 잎말이나방 류는 dsRNA 처리를 통한 기능 연구가 용이할 수 있다는 것을 제시하고 있다. 복숭아순나방을 대상으로 진행한 RNA 간섭 연 구는 야외에서 수컷 유인력을 분석하여 이뤄졌다. 이러한 분석 이 이뤄진 시기가 7월말 경으로 야외 3 세대 성충이 발생되는 시기이다(Kim et al., 2009). 살아있는 암컷 성충을 미끼로 유인 력을 분석한 결과로서 비표적 dsRNA 처리한 대조구의 경우 수 컷을 유인하는 능력을 유지한 반면에 Gm-comp1575에 특이적 dsRNA가 주입된 암컷의 경우는 거의 유인력을 상실하게 되었 다. 이러한 결과는 Gm-comp1575 유전자가 수컷을 유인하는 성페로몬 생합성에 관여하였을 것으로 추정된다. 그러나 앞에 서 기술한 바와 같이 정확한 촉매 부위는 추후 기능 연구를 통 해 밝혀질 필요가 있다.

이상의 결과는 복숭아순나방 성페로몬 샘에서 발현되는 불 포화효소인 Gm-comp1575가 암컷 성충으로 하여금 수컷을 유 인하는 데 생리적 기능을 갖는 것으로 제시하고 있다.