폴리드나바이러스(polydnavirus: PDV)는 이중나선형 DNA 바이러스로서 일부 맵시벌상과(Ichneumonoidea) 내부기생봉에 공생한다(Kim, 2006). PDV는 곤충 바이러스의 분류군으로 브 라코바이러스(bracovirus: BV)와 이크노바이러스(ichnovirus: IV)의 두 개 속(genera)으로 구성된다(Webb et al., 2000). BV 와 IV는 바이러스 입자 구조에서 차이를 보이고, 바이러스 게 놈 구성에서 상이하다(Webb et al., 2006). 이들의 기주 기생봉 도 차이를 보여 BV는 고치벌과(Braconidae), IV는 맵시벌과 (Ichneumonidae)의 기생봉에 각각 공생한다. 이들의 공통조상 은 아직 밝혀지지 않았지만, BV의 경우는 배큘로바이러스와 유사한 nudivirus의 조상형에서 기원된 것으로 밝혀졌으나 (Bézier et al., 2009), IV의 경우는 이와는 다른 조상형을 가지 고 있을 것으로 추정되어(Volkoff et al., 2010) 이들은 각각 서 로 독립적으로 기원되어 수렴진화를 겪었을 것으로 추정하고 있다(Herniou et al., 2013).

PDV 증식은 기주 기생봉의 게놈에 자신의 게놈을 두는 프로 바이러스(provirus) 형태로 기주 세대와 함께 세대를 이어가는 수직 전파형태를 보인다(Stoltz et al., 1990; Bézier et al., 2013). PDV의 수평전파는 기주 게놈에서 자신의 일부 게놈을 복제하 여 바이러스 입자로 형성하면서 야기된다(Wyler and Lanzrein, 2003). 한편 PDV의 게놈은 두 부분으로 구성되어 복제 과정 동 안 복제되어 바이러스 입자에 들어가는 피복(encapsidated) 게 놈과 바이러스 입자에 들어가지 않는 비피복(unencapsidated) 게놈으로 구분된다(Strand and Burke, 2013). 피복게놈은 바이 러스 병원성 유전자를 함유하는 반면, 비피복게놈은 바이러스 의 복제에 관여하는 유전자로 구성된다(Strand and Burke, 2015). PDV의 복제는 기주 기생봉 암컷 난소의 난소받침의 표 피세포에서 일어나며, 복제된 바이러스 입자는 측수란관 내강 으로 축적된다(Kim and Ryu, 2007). 이러한 PDV의 수평전파 과정 중에 나타난 바이러스 입자는 기주 기생봉이 피기생체의 혈강에 자신의 알을 산란할 때 함께 피기주로 침입하게 된다.

PDV 바이러스 입자는 피기생체에서 다양한 조직에 감염을 일으키게 된다. 주로 혈강의 혈구세포에 감염하여 혈구의 면역 기능을 저하시켜 기주 기생봉을 피기생체 면역 반응으로 부터 보호하게 한다. 또한 지방체 및 다양한 조직에 감염을 일으켜 기주가 영양분을 이용하는 것을 막아 기생봉의 발육에 유리한 조건을 만들게 된다. 또한 기주 내분비계를 교란하여 용으로 변 태를 억제하게 한다. 따라서 PDV의 유전자 발현은 피기생체의 다양한 생리를 교란하여 기생봉의 생존과 발육을 도모하게 하 는 데 필수적 기생요소가 된다.

프루텔고치벌(Cotesia plutellae)은 고치벌과에 속한 내부 기생봉으로 배추좀나방(Plutella xylostella)과 미국흰불나방 (Hyphantria cunea)의 어린 유충에 특이적으로 기생한다(Kim et al., 2004). 이 고치벌의 기생은 피기생체 기주에게 면역저하 는 물론이고 발육지연을 유도한다(Ibrahim and Kim, 2006; Kwon et al., 2010). 이러한 생리적 변화는 프루텔고치벌이 갖 고 있는 PDV, 기형세포, 난소단백질의 적어도 3가지 기생인자 가 관여하고, 이들이 상호 협력적으로 작용하여 궁극적으로 기 생을 성공적으로 이루게 한다(Basio and Kim, 2006). 이 가운 데 PDV는 프루텔고치벌의 난소받침 부위에서 최초로 발견되 었으며 Cotesia plutellae bracovirus (CpBV)라 명명되었다 (Bae and Kim, 2004). CpBV의 피복게놈 크기는 약 540 bp로서 157개의 open reading frames (ORFs)을 포함하고 있다(Chen et al., 2011). 최근 CpBV의 비피복형게놈이 프루텔고치벌의 전장서열 분석으로 밝혀지고 있고, 이들 사이의 상호 게놈 구성 이 일부 분석되었다(Kim and Kim, 2016).

CpBV의 피복게놈은 피기생체인 배추좀나방에서 발현되어 다양한 생리적 변화를 유발한다. 이 게놈의 많은 ORF가 진핵 생명체 및 타 바이러스 유전자들과 유사한 유전자군으로 형성 되어 있는 데, 이 가운데 가장 구성 유전자가 많은 PTP (protein tyrosine phosphatase) 유전자군은 혈구세포의 단백질에 인산 화 정도를 변경하여 면역억제를 유발하는 것으로 밝혀졌다 (Ibrahim and Kim, 2008). 유사한 PDV인 MdBV (Microplitis demolitor bracovirus)의 경우 이들 PTP가 세포활착에 관여하 는 세포막단백질의 인산화를 억제하여 세포성면역 반응을 억 제하는 것으로 밝혔다(Pruijssers and Strand, 2007). 다음으로 가장 많은 유전자군은 BEN (BANP, E5R and NAC1)으로 피 기생체의 항바이러스에 관여하는 체액성면역을 억제하여 바이 러스 자신을 보호하고 기주 기생봉을 보호하는 역할을 담당한 다(Ali and Kim, 2012). 기주 생리 교란을 위해 CpBV는 또한 기주의 유전자 발현을 전사과정에서 억제하는 CpBV-H4가 발 견되었다(Gad and Kim, 2008, 2009). 진핵생명체의 히스톤 H4 와 아미노산 서열에서 높은 상동성을 보이나 CpBV-H4는 N 말 단 부위에 37개의 긴 꼬리 구조를 갖는 데 이 부위의 9개 lysine 아미노산은 이 기생인자가 기주 염색사 구조를 변경하여 유전 자 발현을 에피제네틱 방식으로 조절하는 데 핵심적 역할을 담 당하게 된다(Hepat et al., 2013). CpBV-H4가 다양한 기주 유전 자의 발현을 조절하지만, 특히 인슐린유사펩타이드 유전자 발 현을 억제하여 기주의 발육을 지연시키고, 염색사 리모델링 인 자인 SWI/SNF와 lysine demethylase의 발현을 억제하여 기주 발육에 따른 유전자 발현 변화를 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Kumar et al., 2016a,b). 두 유사 단백질인 CpBV-15α와 CpBV- 15β는 진핵생명체의 번역초기인자인 eIF5와 eIF4A와 유사한 구조를 지니고 있다(Lee and Kim, 2008). 이들 기생인자는 기 주 mRNA의 번역을 억제하는 데 특히 CpBV-15β의 경우는 기 주 전사체의 5‘-UTR 구조를 구분하여 바이러스 전사체는 기주 번역기구에 의해 발현되게 하나, 기주 mRNA 가운데 기생에 불리한 유전자들은 선택적으로 번역억제를 유도하게 된다 (Surakasi et al., 2011; Prasad et al., 2014).

Cotesia 속에 속한 기생봉의 PDV에서 기생초기에 높게 발 현되는 EP1 (early expressed protein 1) 유전자가 발견되었다 (Harwood et al., 1994). 이와 상동성이 높은 유전자가 CpBV 피 복게놈에서 7개가 발견되었으며 이들을 ELP (EP1-like protein) 로 명명되었다(Choi et al., 2005; Chen et al., 2011). 이 가운데 가장 발현량이 높고 지속적으로 발현되는 유전자가 ELP1으로 이 유전자의 발현은 혈구세포의 치사를 유발하는 세포독성을 지녔다(Kwon and Kim, 2008). 최근 CpBV 유전자를 이용하여 해충 방제에 이용하는 방안 가운데 내충성 작물 육종이 실현 가 능한 전략으로 입증되었다(Kim et al., 2016). 본 연구는 CpBVELP1 유전자의 살충력을 검증하여 작물육종의 유전자원으로 응용 가능성을 분석하기 위해 진행되었다. 이를 위해 이 단백질 의 순수 분리를 통해 생리 교란 및 살충력을 분석하였고, 이를 기반으로 담배를 이용하여 형질전환 작물을 제작하여 응용 기 능성을 검증하였다.

재료 및 방법

파밤나방 증식 및 조직 추출

이 연구에 사용한 파밤나방은 안동지역 파밭에서 채집한 유 충을 항생제가 빠진 Goh et al. (1990)의 인공사료를 먹이로 약 10년간 실내 누대 사육한 집단을 이용하였다. 형질전환 담배를 섭식을 통해 생물검정한 발육시기는 1령 유충이고 단백질 혈강 주입에 따라 독성을 분석한 시기는 5령 유충이다. 혈구 조직시 료는 5령 유충을 대상으로 복부 다리를 절단한 후 빠져나오는 혈림프를 수거하여 1,500 x g의 원심력으로 혈장을 제거하고 가 라앉은 침전물을 다시 0.7% NaCl이 포함된 100 mM 인산완충 용액(phosphate buffer saline: PBS)으로 현탁시켜 준비하였다.

세포배양

Sf9 세포주(IPLB-Sf21-AE)는 Spodoptera frugiperda의 번 데기 난소 조직에서 유래되었으며, 5% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, Daegu, Korea) 및 antibiotic-antimycotic 복합체(Cat. No. 15240-062, Gibco, Grand Island, NY, USA)를 첨가한 TC100 곤충세포배양액(Cat. No. LM505-01, Hyclone)에서 배양 되었다. Sf9세포는 25 cm² tissue culture flask (Cat. No. 156340, Nunc, Roskilde, Denmark)를 이용하여 28℃ 조건에서 증식되 었다.

암 세포주로서 MCF-7 (Korean Cell Line Bank (KCLB) No. 30022)과 MDA-MB-231 (KCLB No. 30026)은 인체 유방암 유래이다. 반면에 LOVO (KCLB No. 10229), HC116 (KCLB No. 10247), SW480 (KCLB No. 10228)은 모두 대장암 유래이 다. 이들 세포들은 모두 10% FBS와 항생제(100 U/mL penicillin, 100 ㎍/mL streptomycin)가 포함된 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)/F-12 (1:1, v/v)를 이용하여 배양하였다. 세 포배양은 75 cm² tissue culture flask (Cat. No. 156499, Nunc) 를 이용하여 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 이뤄졌다.

재조합 배큘로바이러스 및 과발현

CpBV-ELP1은 Jung et al. (2006)의 방법으로 배큘로바이러 스에 재조합되었다. Budded virus 형태의 배큘로바이러스 현탁 액(10⁷ plaque-forming unit/mL)을 25 cm² tissue culture flask에 미포화(subconfluent) 상태로 증식된 Sf9 세포에 2시간 접종하 고, 다시 새로운 TC100 세포배양액으로 치환하여 72시간 배양 하여 상등액을 수거하였다. 이러한 방법으로 전체 1 L의 배양 액을 모아 단백질 분리에 이용하였다.

CpBV-ELP1 단백질 분리

Ammonium sulfate 분리. CpBV-ELP1의 과발현을 통해 얻 어진 세포배양 상등액은 차등적 ammonium sulfate (Sigma- Aldrich Korea, Seoul, Korea) 농도(0-25, 25-50, 50-75, 75-100%) 로 단백질을 분리하였다. 각 염농도에서 30분간 얼음 속에서 반 응시키고, 이후 13,500 x g에서 10분간 원심분리하여 농도별 단백질 침전물을 얻었다. 이후 상등액은 다음 단계의 염농도 침 전 반응으로 이어지게 하였다. 각 농도 구획별로 분리된 단백질 은 Bradford (1976) 방법을 이용하여 전체 단백질량을 분석하 였고, 10% SDS-PAGE를 통해 단백질 구성을 분석하였다.

Size-exclusion 크로마토그래피. 컬럼(길이 1.5 m × 직경 1 cm) 내부의 고정상은 100 kDa 이상의 단백질 크기를 배척할 수 있는 수지(Sephadex G-100, Sigma-Aldrich Korea)을 이용하 였다. 이동상은 0.01% Triton-X100을 포함한 PBS를 이용하였 다. Ammonium sulfate의 25-50%, 50-75%, 75-100% 침전물 을 혼합하여 분리될 시료로 준비하였다. 이 단백질 시료를 대상 으로 size-exclusion 크로마토그래피의 분획 채취는 2 mL의 부 피로 분리될 단백질 시료가 고정상으로 모두 이동한 후 총 75개 의 분획을 얻었다. 단백질이 검출된 분획 시료들을 바탕으로 10% SDS-PAGE로 목표 단백질을 추적하였다.

이온교환 크로마토그래피. 위와 동일한 컬럼을 이용하여 음 이온 교환수지(DEAE, Sigma-Aldrich Korea)를 이용하였다. 분리 초기에 이동상도 동일한 PBS 용액을 이용하였으나, 흡착 된 단백질을 분리시키기 위해 0.5 M NaCl을 포함한 PBS가 20 번 분획을 받은 이후에 이용되었다. 목표 단백질의 추적은 10% SDS-PAGE를 이용하였다.

CpBV-ELP1의 살충력 생물검정

단백질 분리된 CpBV-ELP1의 살충력 검정은 혈강 주입과 경 구 섭식실험을 통해 이뤄졌다. PBS에 서로 다른 농도(0, 0.125, 0.25, 0.5, 1 μg/mL)로 희석한 단백질을 각 파밤나방 5령충(5령으 로 탈피 후 1일) 개체 마다 2 μL의 부피로 미세주사위(Hamilton, Reno, NV, USA)를 이용하여 복부 첫 번째 다리를 통해 혈강에 주입하였다. 처리된 개체는 인공사료로 상기의 사육조건에 사 망 유무를 관찰하였다. 살충율은 처리 5일 후에 산출하였다. 섭 식 처리는 배추잎(3 × 3 cm) 크기로 자르고 서로 다른 농도의 CpBV-ELP1 용액(0, 0.25, 0.5, 1, 2 μg/mL)에 5분간 침지하였 다. 처리된 배추잎을 파밤나방 5령충(5령으로 탈피 후 1일)에 게 24시간 섭식하게 하고, 이후에 처리되지 않은 건전 잎을 매 일 공급하여 주었다. 사망율은 초기 처리일로 부터 5일 경과 후 분석하였다. 혈강주입 및 경구처리는 모두 반복 당 10마리로 3 반복으로 진행하였다.

형질전환 작물체의 생물검정은 담배잎을 3 × 3 cm 크기로 자른 후 파밤나방 1령충을 사용하여 10마리씩 3반복으로 처리 하였다. 살충율은 매 24시간 간격으로 조사하였다.

CpBV-ELP1의 세포독성

파밤나방에 대한 혈구치사효과. 파밤나방 5령충(5령으로 탈 피 후 3일)을 대상으로 순수 분리된 CpBV-ELP1 단백질(1 μg/ μL)을 2 μL 주입한 후 25℃에서 24시간 경과시켰다. 처리된 개 체들로 부터 혈림프를 채취하고 hemocytometer (Marienfeld, Germany)를 이용하여 총혈구수를 계수하였다. 이때 총혈구수 는 1 mL에 존재하는 전체 혈구수로 표기하였다. 대조구로서 CpBV-ELP1 단백질을 희석할 때 사용한 PBS를 처리하였다. 각 처리는 3반복으로 실시되었다.

인체 암세포주에 대한 세포활성분석. 세포활성은 MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Cat. No. M-2128, Sigma-Aldrich Korea, Korea) 염색약을 이용하 여 분석되었다. 처리될 세포 10,000개/50 μL를 96 well plate 각 각에 분주하였다. CpBV-ELP1 단백질 시료는 세포 배양액으 로 희석하였으며, 50 μL의 용량으로 세포 현탁액에 첨가 후 3 7℃에서 24시간 처리하였다. 이후 20 μL의 MTT (5 mg/mL)를 첨가하여 28℃에서 5시간 처리하였다. 이후 다시 70 μL의 25% sodium dodecyl sulfate를 첨가한 후 상온에서 16-18시간 방치하 여 형성된 formagen을 용해시켰다. 이후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 세포별 및 처리 농도별 3반복으로 실시되었다.

CpBV-ELP1 발현 담배 제작

CpBV-ELP1 유전자의 판독틀(open reading frame: ORF) 영역을 Bam HI 인식서열이 첨가된 정방향 프라이머(5'-GGAT CCATGTTCAACAAAGTAGTC-3')와 Sma I 인식서열이 부 가된 역방향 프라이머(5'-CCCGGGCTATTGCAGCCGATA ACTAGGA-3')를 사용하여 증폭하였다. 이때 사용된 PCR 조 건은 94℃에서 5분 동안 초기 변성반응 후, 94℃에서 30초, 5 0℃에서 30초 그리고 72℃에서 1분의 일련의 반응 주기로 35 회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응을 추가하였다. 얻어진 PCR 산물을 pCR2.1 클로닝벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 삽입하여 증식된 재조합 플라스미드를 분리하여 제한 효소 Bam HI과 Sma I으로 절단하였다. 한편 삽입될 pBI121 (GSL Biotech, Chicago, IL, USA) 벡터는 CaMV 35S 프로모 터 아래의 Bam HI 부위와 opaline synthase terminator (NOS-T) 위의 Sma I 부위를 제한효소로 절단하여 리포터 유전자로 이 용되는 β-glucuronidase (GUS) 유전자의 ORF 영역을 제거하 여 이 부위에 CpBV-ELP1 유전자를 삽입하여 재조합벡터 (pBI121-ELP1)를 제조하였다. pBI121-ELP1를 뿌리혹세균 (Agrobacterium tumefaciens)에 전기충격으로 형질전환하였 다. 이때 A. tumefaciens LBA4404 (Takara, Otsu, Shiga, Japan) 세포(electro-cells) 20 μL에 상기 pBI12-ELP1 DNA 1 ng을 혼 합하고, 1.25 KV의 전기충격(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 가한 후 SOC 배지(Sambrook et al., 1989)를 첨가하여 30℃에 서 200 rpm으로 1시간 동안 진탕 배양하였다. 형질전환된 세균 을 kanamycin과 streptomycin이 함유된 Luria-Bertani (LB) 고 체배지(Sambrook et al., 1989)를 사용하여 30℃에서 2일 동안 배양하였다. 선발된 균총은 다시 DNA 염기서열로 벡터와 삽 입체 ORF의 방향을 확인한 후 LB 액체배지를 사용하여 28℃ 에서 2일 동안 200 rpm으로 배양하였다. 이후 얻어진 세균은 캘러스(callus) 유도 액체배지(배지 1 L 기준: 4.4 g MS 배지, 20 g sucrose, 2 mg α-나프탈렌 아세트산(NAA), 0.5mg 6-벤질아 미노퓨린(BAP), pH 5.8) 40 ml에 재현탁하였다. Nicotiana tabacum Xanthi 잎 조각을 아그로박테리움 현탁액에 20분 동 안 침지시킨 후 28℃, 암조건 하에서 2일 동안 phyto agar (8g/L)를 포함하는 캘러스 유도 배지에서 증식시켰다. 그 후 캘 러스 선택배지(1 L 기준: 4.4 g MS 배지, 20 g sucrose, 0.1 mg NAA, 0.5 mg BAP, 8 g phyto agar)로 옮겨서 28℃, 암조건 하 에서 7일 동안 증식하였다. 발아(shooting)를 유도하기 위하여, 담배 캘러스를 슈팅배지(1 L 기준: 4.4 g MS 배지, 20 g sucrose, 0.1 mg NAA, 0.5 mg BAP, 8 g phyto agar, 250 mg cefotaxime) 에 놓아두었다. 발아를 유도한 후 뿌리형성(rooting)을 유도하 기 위하여, 발아된 담배를 루팅배지(1 L 기준: 4.4 g MS 배지, 20 g sucrose, 8 g phyto agar, 250 mg cefotaxime)에 3주 동안 증식시켰다. 이 후 원예용 상토에 1주 동안 적응시킨 후 온실에 옮겨져 성장시켰다. T0 세대(형질전환 첫세대)의 담배를 자가 수정하여 T1 세대(형질전환 2 세대) 종자를 얻었다.

형질전환 담배의 CpBV-ELP1 발현 분석

Kim et al. (2016)에 기술된 방법을 이용하여 형질전환된 담 배의 CpBV-ELP1 발현 분석은 게놈 DNA를 대상으로 PCR 방 법으로 진행하였고, 다시 RNA 추출하여 RT-qPCR 그리고 최 종적으로 단백질의 발현은 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)로 진행되었다. ELISA를 위해 Kwon and Kim (2008)에 제작된 항체를 이용하였다. 표준 단백질은 본 연구에 서 분리된 CpBV-ELP1 단백질을 정량화하여 이용하였다.

결 과

CpBV-ELP1 단백질 분리

배큘로바이러스 발현시스템으로 합성된 CpBV-ELP1 단백 질을 일련의 단백질 분리 기술을 이용하여 분리하였다(Fig. 1). CpBV-ELP1은 signal peptide를 가지고 있으며, 이 단백질이 Sf9 세포 배양용액으로 분비되어 나오는 것을 확인하였다. 이 배양액(약 120 mg/L)을 모아 ammonium sulfate (AS)를 이용 하여 단백질 분획을 시도하였다(Fig. 1A). AS 농도별로 네 가 지 서로 다른 분획에서 25-50%, 50-75%, 75-100% 분획에서 살충력을 나타냈다. 또한 이들 분획은 모두 CpBV-ELP1의 기 대 분자량인 27 kDa 크기의 단백질 밴드를 보유하였다. 이후의 단백질 분리는 이 27 kDa 단백질 밴드를 추적하였다. AS 세 분 획(25-100%: 약 45 mg)을 모아서 size exclusion 크로마토그래 피를 이용한 단백질 분리 기술을 적용하였다(Fig. 1B). 이들 통 해 얻어진 75개의 분획 가운데 31-40번 분획들이 27 kDa 단백 질 밴드를 보유하였다. 이들 10개의 분획 단백질을 모아 이온교 환 크로마토그래피를 실시하였다(Fig. 1C). CpBV-ELP1은 DEAE에 흡착되었고, 이를 0.5 M NaCl로 분리하였다. 이를 통 해 27 kDa 단백질 포함하고 비표적 단백질 적은 28, 29번 분획 을 모아 최종 CpBV-ELP1 분리 단백질 약 1.5 mg을 얻었다 (Fig. 1D).

CpBV-ELP1 단백질 세포독성

파밤나방을 대상으로 CpBV-ELP1의 혈구세포에 미치는 영 향을 분석하였다(Fig. 2A). 파밤나방 5령 가운데 탈피 후 3일 경 과된 유충이 가장 높은 혈구밀도를 지닌다(Park and Kim, 2012). 이 시기를 대상으로 2 μg의 순수 분리된 CpBV-ELP1을 주입시킨 결과 처리 후 24시간이 경과하였을 때 뚜렷한 총혈구 수 감소가 관찰되었다. 대조구의 경우 8.2 × 10⁶ cells/mL의 총 혈구수를 보였으나, CpBV-ELP1을 처리하게 되면 4.0 × 10⁶ cells/mL의 낮은 총혈구수 밀도를 보였다.

혈구세포에 대한 세포독성을 갖는 CpBV-ELP1가 다른 세 포들에 대해서도 이러한 독성을 갖는지를 규명하는 것은 이 유 전자의 살충기작을 이해하는 데 도움이 된다. 이에 5 종류의 서 로 다른 인체 암세포에도 영향을 주는 지를 분석하였다(Fig. 2B). CpBV-ELP1은 모든 암세포에 대해서 세포독성을 보였다. 특히 대장암 세포주인 HC116와 LOVO가 높은 감수성을 나타 냈다.

CpBV-ELP1 단백질 살충력

CpBV-ELP1의 세포독성 효과는 이 단백질이 살충력을 가 질 수 있다는 것을 내포하였다. 이를 분석하기 위해 서로 다른 농도의 CpBV-ELP1 단백질을 파밤나방 5령충 혈강에 주입하 였다(Fig. 3A). CpBV-ELP1은 농도가 증가함에 따라 살충력이 증가하는 양독반응을 보였다. CpBV-ELP1의 주입 농도가 1 μg 이상에서 최대 살충력을 나타냈다. 경구독성 작용이 혈강에 주 입한 농도에 비해 1,000배 높은 농도에서 일어났다(Fig. 3B). 이러한 경구독성은 5령충의 경우 최대 약 50% 까지 나타냈다.

형질전환 식물체 (Xanthi-ELP1)의 살충력 검정

CpBV-ELP1을 발현하는 담배가 제작되었다(Fig. 4). 이 바 이러스 단백질의 발현을 확인하기 위해 각 발현체별로 게놈 DNA을 추출하여 PCR로 확인하였다. 선발된 10개체는 모두 CpBV-ELP1을 발현하는 것으로 나타났다(Fig. 4A). 반면에 비형 질전환체는 CpBV-ELP1의 판별 617 bp 증폭물이 나타나지 않았 다. RT-PCR을 이용하여 이들 형질전환체 담배가 CpBV-ELP1 유전자를 발현하는 지를 검증하였다(Fig. 4B). 분석된 10개체는 모두 이 바이러스 유전자를 발현하였다. 다시 이들 CpBV-ELP1 을 발현하는 형질전환체 담배 잎에 있는 CpBV-ELP1 단백질 의 함량을 알아보기 위해 ELISA 방법으로 분석한 결과 이들 모 두는 대조구(비형질전환체)가 나타내는 기저 신호에 비해 높은 단백질 함유 신호를 나타냈다(Fig. 4C). 그러나 이들 형질전환 체 사이에 CpBV-ELP1의 함유량은 상이한 것으로 나타났다. ELISA 신호를 기준으로 8번 개체가 가장 높은 CpBV-ELP1 단 백질을 발현한 것으로 나타났다. 이들 개체를 파밤나방 1령충 에 섭식시켜 살충력을 검증하였다(Fig. 4D). CpBV-ELP1을 발 현하는 형질전환 담배 모두는 파밤나방에 살충력을 나타냈으 며, 이 가운데 4번과 10번 개체가 가장 살충력이 높은 것으로 나 타났다.

고 찰

해충에 대한 내충성을 주는 형질전환작물을 개발하는 데 이 용될 외래 유전자는 대상 해충에 대해서 경구 독성을 가져야 한 다. 이를 증명하기 위해 본 연구는 먼저 이 단백질을 배큘로바 이러스를 이용하여 과발현 및 순수 분리를 진행하였다. 일련의 단백질 분리 과정을 통해 본 연구는 CpBV-ELP1이 충분히 농 축된 분획을 얻었다. 이를 통해 얻어진 단백질은 혈강주입 및 경구를 통해 살충력을 분석하였다. 혈강주입의 경우는 파밤나 방 5령충을 대상으로 개체 당 1 μg 이상에서 80% 이상의 높은 살충력을 나타냈다. 경구처리에서도 CpBV-ELP1은 살충력을 주었으나, 혈강 주입에 비해 매우 높은 농도로 처리가 필요하였 다. CpBV-ELP1의 경구독성에 대해 아직 정확한 독성기작은 파악되지 않았으나 이 단백질의 세포독성에 기인된 것으로 추 정된다. 본 연구는 이 단백질이 곤충의 혈구세포는 물론이고 인 체의 암세포주에 대해서 세포독성이 있는 것을 보여 주었다. 이 단백질은 기생초기에 다량으로 합성되어 기주 혈림프에 존재 한다(Harwood et al., 1994). Kwon and Kim (2008)은 이 혈강 에 존재한 단백질이 다양한 조직의 세포 내부로 침입이 가능한 것으로 보여 주었다. 본 연구는 여기에 이 단백질이 높은 세포 독성효과가 있는 것을 보여 주었다. 따라서 경구 처리로 소화관 으로 들어간 CpBV-ELP1은 소화관의 상피세포를 침입하였을 것이고, 여기서 세포독성을 발휘한 것으로 독성 작용을 추정하 여 볼 수 있다.

경구독성을 지닌 CpBV-ELP1을 담배를 대상으로 형질전환 작물을 제작하였다. 뿌리혹세균인 아그로박테리움을 이용한 형질전환은 높은 효율의 유전자 도입을 주었다. T1 세대로 선 발된 10개의 담배 개체 모두는 이 도입유전자를 발현하였으며, 모두 파밤나방 1령충에 대해서 살충력을 나타냈다. 그러나 살 충력은 최대 50%를 넘지 못했다. 모든 폴리드나바이러스 유래 유전자의 도입이 유사한 살충력을 보이는 것은 아니다. 최초로 폴리드나바이러스를 이용하여 형질전환담배를 제작한 것은 이 크노바이러스가 보유하고 있는 Cys-motif 유전자이다(Maiti et al., 2003). 이전의 유사한 Cys-motif 유전자가 기형세포에서 유 래된 TSP14으로 높은 경구독성으로 형질전환된 담배가 나방 류 해충에 대해 높은 살충력을 발휘하였다. 반면에 유사한 브라 코바이러스에서 유래된 ankyrin 유전자로 형질전환된 담배는 50% 미만의 살충력을 주었다(Di Lelio et al., 2014). 대조적으 로 CpBV-CST 유전자로 형질전환된 담배는 100%의 살충력을 나타냈다(Kim et al., 2016). 이러한 결과는 물론 대상 해충이 달라지면 상이한 살충력 결과를 줄 수 있기에 대상 해충을 겨냥 한 살충유전자의 탐색이 형질전환작물을 개발하는 데 필수적 이라는 것을 제시하고 있다. 향후 본 연구에서 개발된 형질전환 작물을 대상으로 적용 해충 범위를 분석하는 연구가 진행될 필 요가 있다.