풀무치(Locusta migratoria)는 Locusta속에 포함된 단 하나 의 종으로 전 세계적으로 넓은 지역에 분포를 하고 있다(Ma et al., 2012). 풀무치의 유럽지역에서의 발생은 최근에 들어서 상 당히 줄어들었지만, 아프리카, 아시아, 오스트레일리아와 뉴질 랜드에서 높은 빈도로 대발생을 하고 있다. 이러한 넓은 발생범 위 때문에 풀무치의 지역별 아종들이 존재할 거라는 보고가 있 다(Chapuis et al., 2008). 최근의 아프리카, 유럽, 아시아, 오세 아니아 지역에서 채집된 풀무치의 마이토콘드리아 유전체에 대한 연구결과는 아프리카에서 기원한 풀무치가 유럽대륙을 거쳐서 러시아와 중국북구지역을 거쳐서 일본으로 퍼져 나온 북방계통과 아프리카와 인도와 동남아시아와 오세아니아와 중 국의 남부지역으로 퍼져나간 남방계통으로 나뉜다는 보고가 있지만(Ma et al., 2012), 모든 연구자가 동의할 수 있는 집단간 의 생식가능성 연구 또는 화석에 대한 연구 등이 이루어지지는 않았거나 불가능하여 향후 추가연구가 필요한 실정이다.

2014년 8월에 전라남도 해남군 산이면 간척지의 친환경 사 료작물 재배지역에서 풀무치가 대량발생을 하여, 인근의 벼과 작물과 사료작물에 막대한 피해를 입혔다(Kim et al., 2014). 이 는 한국에서 군집 형 풀무치가 대량 발생하여 농작물에 피해를 준 최초의 보고로서 기후변화에 따른 온난화와 강우패턴의 변 화가 대발생의 원인이라고 추측은 되지만, 정확한 원인의 규명 을 위해서는 향 후 추가적인 연구가 필요한 실정이다.

풀무치가 주요한 식량작물의 해충이 되는 이유는 이들이 발 생밀도에 따라서 상 전이가 일어나기 때문이다(Ernst et al., 2015). 낮은 밀도에서는 상대적으로 위해성이 낮은 단독 형으 로 존재를 하는 풀무치는 밀도가 높아져서 먹이의 부족이 나타 나게 되면 군집 형으로 변화하게 된다. 군집 형 풀무치의 경우 는 단독 형에 비하여 머리의 저작기구가 커지고 전체적인 충체 의 크기도 커지면서 군집으로 이동을 하면서 이동경로에 있는 작물들을 초토화 시켜서 식생을 파괴하는 것으로 알려져 있다 (Yamagishi and Tanake, 2009; Ernst et al., 2015).

해남군에서 풀무치가 대량으로 발생을 하고 단독 형에서 군집 형으로 변화된 전이 기전을 밝혀내기 위해서는 우선 해남지역에 서 대량 발생한 풀무치에 대한 계통분석이 필요하다. 이에 본 연 구팀은 해남지역에서 채집된 풀무치와 다른 지역 계통간의 계통 학적인 연관성을 분석하기 위하여 마이토콘드리아에 존재하는 유전자들에 대한 분석을 수행하였다. GenBank에 등록된 다양 한 지역계통의 풀무치들의 16S ribosomal RNA (16S rRNA)와 displacement-loop (D-loop) 염기서열을 이용하여 비교 분석을 수행하였다. 그 결과 해남에서 발생한 풀무치는 북방계통 중 유 라이사 대륙지역형과 가장 유연관계가 높음을 밝혀냈다.

재료 및 방법

풀무치 채집

2015년 9월에 전라남도 해남군 산이면 간척지에서 풀무치 (Locusta migratoria)를 채집하여 분석에 사용을 하였다.

마이토콘드리아 유전체 DNA 추출방법

풀무치의 마이토콘드리아 유전체 DNA를 포함하는 전체 유 전체 DNA는 Qiagen DNeasy Blood & Tissue genomic DNA extraction kit (Qiagen, Venlo, Netherlands)를 사용하여 제조 사의 방법에 따라서 추출을 하였다. 풀무치의 뒷다리를 잘라내 서 lysis 용액을 이용하여 균질화 시킨 후, proteinase K를 추가 하고, 56℃에서 10분간 가열을 한다. 동일한 튜브에 100% Ethanol을 추가한 후, 15초간 vortex mixer를 사용하여 썩어준 후, 상온의 원심분리기를 이용하여 8,000 rpm에서 1분간 회전 시켜서 상층액을 분리해 낸다. 분리된 상층액에는 유전체 분리 용 용액을 추가 한 후에, 유전체 분리용 컬럼에 넣고 14,000 rpm 에서 3분간 원심분리한다. 유전체 분리용 컬럼을 새 튜브로 옮 긴 후에 100 μl의 용출용액으로 유전체 DNA를 회수 한다.

풀무치 표준 마이토콘드리아 유전체 지도

L. migratoria migratoria의 마이토콘드리아 유전체 서열 (GenBank accession No. EU287446.1)를 NCBI (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/)에서 획득을 하여 OrganellGenomeDRAW (http://ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/) (Lohse et al., 2013)를 이용하여 마이토콘드리아 유전체 지도를 그렸다(Fig. 1).

마이토콘드리아 16S ribosomal RNA와 D-loop 부위 증 폭방법

기존에 밝혀진 다양한 종류의 풀무치의 마이토콘드리아 유 전체 DNA 서열을 NCBI에서 확보한 후, CLC sequence view 7.7 (Qiagen, Aarhus, Denmark)를 이용하여 서열을 비교하였 다. 비교된 서열을 이용하여 16S ribosomal RNA (16S rRNA) 와 D-loop (Fig. 1) 부근을 증폭시킬 수 있는 primer를 제작하여 연구를 진행하였다. 증폭에 사용된 primer의 서열은 Table 1에 정리되어 있다. 증폭된 DNA 부분은 pGEMT-easy TA cloning kit (Promega, Fitchburg, WI, USA)를 이용하여 cloning 한 후 에 plasmid miniprep kit (Qiagen)로 회수를 하였다. PCR 증폭 DNA 부분을 포함한 plasmid의 양쪽 DNA를 capillary sequencing 를 수행하여 16S rRNA와 D-loop의 서열을 밝혀냈다. 밝혀진 DNA d염기서열은 CLC sequence viewer 7.7로 비교 분석 하 였다.

얻어진 DNA서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI) nucleotide blast를 수행하여 16S rRNA와 D-loop부분을 확인 하였다(Koh Y.H. data not shown). 총 64개 의 풀무치의 16S rRNA RNA 서열과 총 65개의 D-loop 염기서 열을 NCBI에서 확보하여 비교를 하였다. 16S rRNA 와 D-loop 분석을 위한 out-group에 속하는 종은 Schistocerca gregaria gregaria를 이용하여 분석을 수행하였다. 본 분석에 사용된 GenBank accession number는 Fig. 2와 3에 표기를 하였다. 계 통분석결과는 CLC sequence viewer 7.7이 가지는 분석방법 중 에서 Neighbor Joining방법을 이용하였는데, 염기서열간의 거 리는 Kimura 80방법으로 계산을 하였다. Bootstrap분석은 1000번 반복하여 수행을 한 후 circular cladogram으로 결과를 표시하였다. 각각의 분지에는 bootstrap 값(%)을 50이 넘는 경 우에만 표시를 하였다.

결 과

2015년도 풀무치 채집

풀무치의 mitochondria 유전자를 이용하여 2014년도 해남 군 산이면에서 대량 발생한 풀무치의 유전형과 다른 지역 풀무 치계통과의 유전지리학적인 연관성을 확인하기 위하여 대량 발생지역에서 2015년도 9월에 채집을 수행하였다. 2014년도 의 방제의 성공으로 풀무치의 발생빈도는 높지 않았지만, 대 발 생 지역 주위에서 발생이 확인되었고, 채집도 가능하였다. 풀무 치 성충들은 비산능력이 뛰어나서 친환경재배지역의 포장과 농로에서 산발적으로 발견이 되었다. 특이한 점은 자갈밭으로 된 농로에서 휴식을 취하거나, 생식행위를 하거나, 산란을 하는 개체들이 포장 내 보다는 상대적으로 많이 관찰이 되었고, 이들 을 대상으로 채집을 수행하였다. 자갈밭에서 자주 관찰이 되는 이유는 일조에 의하여 농로의 표면 온도가 올라가, 변온동물인 풀무치가 온도가 높은 농로로 이동하여 휴식을 취하거나 다양 한 활동을 하는 것으로 추측된다. 또한 산란관을 농로지표아래 로 삽입을 하고 있는 암컷들도 자주 관찰이 되었다. 이러한 결 과는 풀무치의 경우 농로에서 휴식을 취하거나 생식 행동을 한 후에 농로에 산란을 진행하고, 다음 해에 알에서 깨어난 1령약 충들은 농로에서 아마도 먹이가 존재하고 있는 근접한 포장으 로 이동을 하여 약충 시기를 지낼 것으로 추측 된다.

풀무치 마이토콘드리아 유전체의 구조

풀무치의 마이토콘드리아에는 총 18개의 transfer RNA (tRNA) 들과 4개의 codons recognized들과 7개의 NADH dehydrogenase (ND)들과 3개의 Cytochrome C oxidase (COX)들과 한 개의 Cytochrome B oxidase (CYTB)과 두 개의 마이토콘드리아의 ribosomal RNA들과 D-loop로 구성이 되어져 있다(Fig. 1). 본 연구에서는 마이토콘드리아의 16S rRNA와 D-loop의 DNA서 열을 이용하여 비교분석을 진행하였다.

해남군 산이면 풀무치의 마이토콘드리아 16S rRNA의 서 열비교

해남군 산이면에서 대 발생한 풀무치의 유전학적인 연관성 을 다양한 지역 형에서 보고된 유전자 서열들과 비교를 하였다 (Fig. 2). 해남군 산이면에서 발생하는 풀무치의 16S rRNA의 염기서열은 본 연구에서 비교된 64개의 전 세계 풀무치들에서 확인된 서열과 99%의 상동성을 보여주었지만, 대부분의 경우 2~14개의 gap을 가지고 있었다(Koh, Y.H., data not shown, NCBI nucleotide blast results). Out-group으로 사용된 Schistocerca gregria gregaria의 16S rRNA와 비교해서는 85%의 상동성과 2%의 gap을 가지고 있었다(Koh, Y.H., data not shown, NCBI nucleotide blast results). 해남군 산이면 풀무치s는 16S rRNA 염기서열을 이용한 cladogram phylogenic 분석 결과(Fig. 2) L. migartoria migratoria (GenBank accession No. EU287446.1) 와 Turf, Xinj, China계통(GenBank accession No. JN858173.1) 과 유전적으로 가장 비슷하다는 결과를 얻었다. L. migartoria migratoria은 서 중앙아시아와 동부유럽에서 주로 발견 되는 지역계통이고, Turf, Xinj, China계통은 아프리카에서 퍼져 나 온 두 가지 계통 중의 북방계통의 유라시아 대륙 형으로 분류 (Ma et al., 2012)가 되므로, 해남 산이면 개체군도 북방계통의 유라시아 대륙 형일 가능성을 보여주고 있다.

해남군 산이면 풀무치의 D-loop서열을 이용한 계통분류 분석 결과

풀무치의 마이토콘드리아 유전체에는 12S rRNA와 ILE-tRNA 의 사이에 단백질정보를 포함하지 않는 D-loop 서열을 가지고 있다(Fig. 1). D-loop의 경우는 마이토콘드리아 유전체의 보수 나 복제와도 관여하는 중요한 부분으로 알려져 있고(Fish et al., 2004), 다른 부분보다 변이의 발달이 빠르게 이루어져서 다른 지역에 분포하는 동일한 종간의 유전적인 연관 관계를 밝혀내 는데 유용하게 이용되어지고 있는 염기서열이다(Kim et al., 1999; Kakoi et al., 2007; Khanshour and Cothran, 2013). 곤충 에서는 Schistocerca gregria와 Chorthipppus parallelus의 D-loop 염기서열을 다른 종들과 비교한 연구가 보고된 바 있다 (Zhang et al., 1995). 해남 산이면 채집 풀무치의 D-loop 염기 서열을 이용하여 phylogenetic 분석을 수행한 결과 가장 유전 적을 비슷한 D-loop는 L. migratory tibetensis의 것으로 밝혀졌 다(Fig. 3). 마이토콘드리아 16S rRNA의 비교결과에서 유전적 이 연관성이 높았던 Turp Jinj China계통은 이 번 분석에서는 다른 clade에 존재를 하고 있었다. 16S rRNA와 D-loop의 유전 적인 연관성 분석결과는 해남군 산이면에서 대량 발생한 풀무 치의 경우, 북방계통 유라시아 대륙계통임을 일관성 있게 보여 주고 있다.

토 론

풀무치는 오랜 기간 한반도에 분포를 하여 왔지만, 2014년 이전까지는 주요한 해충으로 간주되지 않았다. 2014년 이전에 는 커다란 문제가 되지 않았던 풀무치가 대량으로 발생을 하여 단독 형에서 군집 형으로 상 전이가 일어난 후, 벼와 사료작물 인 수단그라스와 이탈리안 라이 그라스에 커다란 피해를 가져 온 원인들에 대해서 현재 우리는 전혀 알지를 못하고 있다. 현 재 제안되고 있는 대량 발생에 대한 가설을 크게 두 가지로 나 눌 수 있다. 하나의 가설은 해외에서 대량으로 풀무치가 유입이 되어 대량 발생이 일어 났다는 가설과 다른 하나는 토착종이 기 후변화에 따라서 대 발생을 하였다는 가설이다. 이러한 가설들 의 검증은 해남군 산이면에서 발생한 풀무치의 유전계통을 명 확하게 알아냄으로 수행할 수 있다. 그러므로 본 연구의 가장 중요한 기여는 해남군 산이면에서 대량으로 발생한 풀무치는 16S rRNA와 D-loop의 염기서열비교 분석 방법을 개발한 것이 고 분석결과 해남군 산이면 풀무치는 북방계통 중 유라시아 대 륙형(Fig. 2와 3)일 가능성을 밝혀낸 것이다. 해남군 산이면 풀 무치의 16S rRNA의 염기서열이 비록 다른 지역계통과 매우 높 은 상동성을 보이는 경우도 있지만, 100% 일치하지는 않고 있 고, 특히 D-loop 염기서열은 커다란 차이점을 보이고 있으므로, 첫 번째 가설인 해외 유입설 보다는 국내 기후 변화에 따른 대 량 발생설이 더 합당한 설명으로 사료되지만, 본 연구에서 사용 된 개체수가 한정이 되어있고, 채집 지역도 해남군 산이면 한 곳이라서 정확한 결론을 위해서는 향 후 추가 연구가 필요한 실 정이다.

흥미롭게도 국내기후변화에 따른 풀무치가 대량으로 발생 했다는 가설을 뒤 받침 하는 다른 간접적인 증거들도 있다. 그 중 하나는 최근에 들어서 봄과 초여름의 고온에 따라 다양한 종 류의 메뚜기 종들의 발생 증가가 보고된다는 것이다(http://www. korea.go.kr/locgovNews/829703). 2016년도에는 벼메뚜기가 경상북도 예천과 충청남도 부여 지역에서 조기에 출현을 하여 초기 생육단계에 있는 벼입을 가해하는 피해를 입혔음이 보고 되었다. 그러므로, 풀무치의 대량 발생을 가져온 환경변화는 단 지 한 종의 메뚜기목 해충의 대량 발생이 아니라, 한국에서 발 생하는 다른 메뚜기류들의 대발생도 유도할 수 있는 가능성이 있으므로 향후 온도와 강우변화에 따른 발생 변화에 관련한 정 밀한 연구가 필요하다.

해남군 산이면 발생 풀무치가 대량 발생하여 심각한 작물에 대한 피해를 입힌 이유는 그들의 유전형이 북방계 유라시아형 중 L. migratoria tibetensis와 L. migratoria migratoria와 비슷 하기 때문일 수 도 있다. 특히 L. migratoria tibetensis의 경우는 현재까지 알려진 가장 심각한 피해를 입히는 메뚜기과 해충으 로 보고된바 있다(Chen and Zhang, 1999). 그러므로, 향 후 해 남군 산이면의 풀무치와 우리나라의 다른 지역의 풀무치의 마 이콘드리아에 존재하는 다양한 유전자나 전체 유전체에 대한 분석을 완료한다면 풀무치의 유래, 대발생 기전 및 전이기전의 이해에 도움을 줄 것으로 생각이 된다.

마지막 가능성이 높은 원인으로는 최근에 들어서 작물보호 제를 사용하지 않는 친환경 또는 유기농 재배지의 증가가 메뚜 기류의 대량 발생을 유도할 수 있는 하나의 원인 될 수 있다는 점이다. 현재까지 메뚜기류의 발생증가에 따라서 작물의 피해 가 보고되는 지역의 대부분이 친환경 재배지나 주변 지역이다 (Kim et al., 2014) (http://www.korea.go.kr/locgovNews/829703). 그러므로, 메뚜기류들의 대 발생에 따른 추가 피해를 방지하기 위해서는 전국의 친환경 재배지에서 메뚜기류 발생에 대한 지 속적인 예찰 활동이 필요할 것이다.