곤충을 포함한 무척추동물은 항체를 생산하여 병원균들에 대항하는 후천적 면역 반응보다 직접 병원균에 대항하는 선천 적 면역이 잘 발달되어 있다(Tsakas and Marmaras, 2010). 이 러한 선천적 면역반응은 혈구세포들에 의하여 수행되는 세포 성 면역반응과 항생단백질들에 의한 체액성 면역반응으로 구 분된다(Hoffman, 2003; Lemaitre and Hoffman, 2007; Strand, 2008).

특히, 곤충의 혈구세포들에 의하여 수행되는 세포성 면역반 응은 멜라닌화를 포함한 식균작용, 노듈형성, 캡슐형성 등의 방 법으로 병원균/외래물질과 대항하는 기작을 가지고 있는 것으 로 알려져 있다(Gupta, 1985). 외부 침입 병원성 미생물들이 그 램양성 세균, 그램음성 세균, 곰팡이, 기생자 등 침입 주체에 따 라 조금씩 면역반응의 시작과 종결에 관련된 유전자들/관련 단 백질들이 달라질 수 있다. 그 중 곤충의 패턴인식 수용체(pattern recognition receptors: PRRs)가 미생물들의 세포벽 주요 구성 성분들인 peptidoglycan, lipopolysacchride, β-glucans, 다양한 lipoproteins, CpG dinucleotides 등과 결합을 시작으로 세포성 면역 반응이 시작된다(Tauszig et al., 2000; Silverman and Maniatis, 2001).

곤충의 세포성 면역반응의 주체인 혈구세포(hemocytes)는 곤충 종의 다양성, 혈구세포의 형태 및 역할의 다양성 때문에 그 분류 및 동종이 매우 어려운 분야이다. 또한 면역반응의 주 체가 되는 혈구세포의 동종은 한 종의 혈구세포가 담당하기보 다는 때때로 2종, 3종의 혈구세포 협력으로 면역 반응을 수행하 기에 정확한 면역 혈구세포의 동종은 더욱 어려운 실정이다. 따 라서 곤충의 세포성 면역반응을 연구하기 위해서는 연구 대상 곤충의 혈구세포 형태학적 분석이 먼저 완료되어야만 한다.

일반적으로, 곤충 혈구세포는 전혈구세포(prohemocytes; PR), 세포질혈구세포(plasmatocytes; PL), 과립혈구세포(granulocytes; GR), 편도혈구세포(oenocytoids; OE), 구상적혈구세포(spherulocytes; SP), 지방혈구세포(adipohemocytes; AD), 응집혈구세포(coagulocytes; CG) 등으로 구분되고 있다(Jones, 1962; Gupta, 1979; Pandey and Tiwari, 2012). 특히, 곤충은 종의 다양성 때문에 곤충에 따 라 발견되는 혈구세포 종류, 형태, 비율 등 서로 다른 경우가 많 이 존재 한다. 예를 들면, 메뚜기목의 경우 전혈구세포, 세포질 혈구세포, 과립혈구세포, 구상적혈구세포가 주로 발견되며 편 도혈구세포, 응집혈구세포, 지방혈구세포는 일반적으로 관찰 되지 않는다. 원시곤충인 톡토기목(Collembola)의 경우는 단 지 과립혈구세포 한 종만 관찰되는 것으로 알려져 있다(Gupta, 979). 또한 딱정벌레목(Coleoptera), 나비목(Lepidoptera), 파 리목(Diptera)의 경우는 위에서 언급한 모든 혈구세포들이 관 찰되기도 한다. 그러나 곤충 종 별로 관찰하면 그 예외는 많이 발견되는데 초파리(Drosophila melanogaster)의 경우 단 3종 의 혈구세포(세포질혈구세포, 층판혈구세포(lamellocytes), 결 정혈구세포(crystal cell)로 구성되어 있다(Williams, 2007).

위에서 언급한 혈구세포들 중 어떤 혈구세포가 세포성 면역 반응을 담당하느냐를 결정하는 것은 다양한 현미경적 접근 방 법이 필요하다. 정확한 혈구세포 종류와 형태 분류가 선행 되고 외래 물질을 곤충의 혈강(hemocoel)내로 인위적으로 주사하여 시간별로 모든 혈구세포 종류들에 대하여 추적 관찰하면서 결 정할 수가 있다(Giglio et al., 2008). 외래물질이 주입된 곤충의 면역 혈구세포들은 순식간에 활성화 되는 것이 아니라 시간적 차이를 두고 발생되는데 일반적으로 3시간에서 48시간 간격을 두고 발생 하는 것으로 알려져 있다(Kwon et al., 2014). 이는 많은 현미경 작업을 필요로 하는데 연구 대상 곤충이 충분한 혈 구세포의 량을 가지고 있어야 가능하다.

본 연구는 우리나라 대표적인 농· 산업곤충인 흰점박이꽃무 지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유충의 혈구세포를 주사전 자현미경(SEM; scanning electron microscopy)과 투과전자현 미경(TEM; transmission eclectorn microscopy) 두 가지 방법 을 사용하여 혈구세포의 특성 및 형태를 제시하였다. 흰점박이 꽃무지 유충 한 마리는 상당한 량의 혈림프(약 0.5 ml)를 가지 고 있는 장점이 있으며 쉽게 인위적으로 병원균 감염을 유도 할 수 있고, 특히 세포성 면역반응도 활발히 발생하는 것으로 알려 져 있다. 특히 본 연구를 통하여 과립혈구세포의 식균작용을 비 롯하여 리소좀들이 외래물질과 직접 합쳐지면서 외래물질을 제거하는 리소좀과 연관된 세포성 면역반응을 규명하였다.

재료 및 방법

공시 곤충

본 연구에 이용한 흰점박이꽃무지 유충은 Kwon (2009)에 의한 방법으로 사육하였다. 사육 온도는 25±1℃, 광조건은 16:8 (L:D)h, 상대습도는 60 ± 10%로서 살균된 오크나무 톱밥을 먹 이로 제공하면서 사육하였다.

혈림프(hemolymph)와 혈구세포(hemocytes)

대략적인 0.5 ml 정도의 혈림프는 흰점박이꽃무지 유충의 등에서 멸균된 유리 파스츄어피펫(Pasteur pipette)을 사용하여 추출하였다. 특히, 혈림프 추출 전, 흰점박이꽃무지 유충은 70% 알코올로 큐티클 표면을 멸균하였고, 추후 증류수로 다시 세척하여 사용하였다. 약 0.5 ml 정도의 혈림프는 항응고제(98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 17 mM EDTA, 41 mM citric acid, pH 4.5)와 1:1 비율로 혼합하여 혈림프의 응고를 방지하였다. 구세포 관찰을 위해서는 4℃, 1,000 g에서 10 분 간 원심분리 한 후 혈구세포 펠렛은 다시 항응고제로 세척 한 후 시료로 사 용하였다.

주사전자현미경(SEM; Scanning Electron Microscopy)

항응고제와 혼합된 혈구세포 10 ㎕는 0.1% poly-1-lysine으 로 처리된 커버슬립(coverslip)위에 직접 떨구어 사용되었다. 커버슬립에 부착된 혈구세포는 2.5% glutaraldehyde가 들어있 는 cacodylate 버퍼(0.1 M, pH 7.3)에 고정되었다. 그 후, 혈구 세포는 osmium tetroxide 1%로 다시 고정하고 에탄올을 사용 하여 탈수하였다. 위 처리로 준비된 시료를 스터브(stubs)에 올 리고 sputter coater에서 골드 코트화하였고 주사전자현미경 (SEM; LEO 420)으로 시료를 관찰하였다.

투과전자현미경(TEM; Transmission Eclectorn Microscopy)

투과전자현미경은 Huang et al. (2008)에 의해서 발표된 방 법을 변형하여 수행하였다. 전 처리된 혈구세포는 osmium tetroxide 1%로 다시 고정하고 에탄올을 사용하여 탈수하였다. 고정된 시료는 레진(Epon 812)에 임베디드(embedded)한 후 초미세절편기(Pabisch Top Ultra 150)를 사용하여 미세절편을 만들고 200-mesh nickel grid에 절편된 시료를 올려놓았다. 시 료는 아세트산 우라닐로 염색하고 5분간 구연산염에 침전하였 다. 그 후 시료는 투과전자현미경(JEX-1230 transmission electron microscope, JEOL, Tokyo)으로 관찰하였다.

효모(Yeast)의 주입과 혈구세포 관찰

혈구세포의 면역반응을 투과전자현미경으로 관찰하기 위하 여 외래미생물로서 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 선택하 였다. 흰점박이꽃무지 유충에 대한 효모면역반응 유도는 Kwon et al. (2014)에 의해서 정립된 방법을 사용하였다. 본 실험실에 서 제조한 멸균된 미세한 유리 바늘을 사용하여 효모(2.16 × 10⁵ ) 40 ㎕를 등쪽에서 혈강 안으로 피하 주사하였고 주사된 유 충은 정해진 시간별로 혈림프를 추출하여 시료로 사용하였다.

결과 및 고찰

주사전자현미경에 의한 혈구세포 형태적 분류

흰점박이꽃무지 유충은 평균적으로 길이 3 ± 0.5 cm, 너비 1.6 ± 0.4 cm의 크기로서 보통 500 ㎕~1 ml의 혈림프를 가지고 있다. 혈구세포수는 혈림프 1 ㎕ 당 평균 72 개 정도이고 종류 는 6종으로 과립혈구세포(13%), 세포질혈구세포(20%), 편도 혈구세포(1%), 구상적혈구세포(5%), 전혈구세포(17%), 지방 혈구세포(44%)로 구성되어 있음이 보고되었다(Kwon et al., 2014). 흰점박이꽃무지 유충에 존재하는 전체적인 혈구세포의 주사전자현미경 사진은 Fig. 1A와 같다. Fig. 1A에서 나타난 여섯 종의 혈구세포 중 약 1% 정도를 차지하는 편도혈구세포는 동그란 원형으로서 다른 혈구세포보다 크기가 큰 것이 특징이 다(Fig. 1B). 특히 세포막은 어떠한 구조물도 관찰되지 않으며 매우 매끈한 형태로 관찰된다. 누에(Bombyx mori)를 비롯하여 다양한 곤충에서도 편도혈구세포는 대체적으로 크고 세포막이 어떤 구조물이 관찰되지 않는 매끈한 형태로 보고되고 있다(Gupta, 1979). 기능은 멜라닌화를 책임지고 있으며, prophenoloxidase (PPO)를 생산, 분비하여 큐티글에 발생한 상처치료 등에 기여 하는 것으로 알려져 있다(Liu et al., 2013). 최근, 본 실험곤충에 서도 편도혈구세포가 멜라닌화와 연관되어 있음을 보고하였다 (Kwon et al., 2014).

Fig. 1C는 곤충에서 관찰되는 전형적 세포질혈구세포를 나 타내고 있다. 초파리(D. melanogaster)를 비롯하여 다양한 곤 충에서 세포질혈구세포는 세포막에 구조물, 위족(micropapilae 와 filopodia)이 매우 잘 발달되어 있는 것이 특징이다. 또한 병 원균에 대항하는 세포성면역 기작인 식균작용과 캡슐화작용을 수행하는 대표적 혈구세포로 인지되고 있다(Williams, 2007). 그러나 흰점박이꽃무지 유충의 세포질 혈구세포는 세포막의 위족도 잘 발달되어 있지 않았으며 외부미생물에 대하여 어느 정도 면역반응을 보이지만 주된 면역 혈구세포는 아닌 것으로 보고되었다(Kwon et al., 2014). 곤충 지방혈구세포의 경우는 세포질혈구세포의 형태와 유사한 타원형 이며 특히 세포막에 는 어떠한 구조물도 관찰되지 않는 매끈한 형태가 특징이다 (Gupta, 1979). 흰점박이꽃무지 유충의 지방혈구세포도 타원 형이고 세포막은 구조물이 관찰되지 않는 매끈한 형태로 관찰 되었다(Fig. 1D).

흰점박이꽃무지 유충의 과립혈구세포의 경우 편도혈구세포 와 같이 일반적으로 둥근 형태로 관찰되었으나, 그 크기가 편도 혈구세포보다는 작고 다양한 형태의 구조물들이 관찰되면서 때때로 불규칙적인 형태도 관찰된다(Fig. 1E). 최근, 광학현미 경과 다양한 염색법을 활용하여 본 곤충의 과립혈구세포의 면 역학적 활성화가 보고되었다(Kwon et al., 2014). 주사전자현 미경를 사용하여 관찰된 결과도 기 보고된 바와 같이 다양한 형 태의 구조물들이 세포막에서 관찰되는 것을 알 수 있었다(Fig. 1E). Fig. 1에서와 같이 여섯 개의 세포 중 과립혈구세포만이 세 포막의 형태가 가장 다양하게 발달된 것을 알 수 있었다.

그 외에 구상적혈구세포와 전혈구세포는 비교적 크기가 작 으며 둥근 원형의 형태를 보이는 것으로 관찰 되었다(Fig. 1F와 G). 초파리에서 전혈구세포는 초파리에 존재하는 모든 혈구세 포 형성의 조혈구세포로서 인지되고 있다(Williams, 2007). 이 러한 다른 세포로의 분화는 Hippo, GATA, RUNX, Friend-of- GATA families (Serpent (Srp)) 전사조절단백질들에 의하여 수 행되는 것으로 알려져 있다(Williams, 2007; Milton et al., 2014). 현재까지, 흰점박이꽃무지 유충을 포함하여 대부분 곤충에서 어떠한 혈구세포나 조직이 조혈구세포로의 역할을 하는지? 어 떤 전자조절단백질들과 조건이 다양한 혈구세포로의 분화를 유도하는지? 등에 대한 연구는 곤충학 전반적으로 매우 초보적 인 단계에 있다. 예를 들어, 전혈구세포만 분리 배양 할 수 있다 면 위와 같은 질문에 정답을 유추할 수 있으리라 판단되나 아직 까지 특정 곤충들의 특정 혈구세포 들의 선택적 배양은 어려운 실정에 있다.

일반적으로 딱정벌레목은 위 여섯 종의 혈구세포와 함께 응 집혈구세포도 함께 관찰이 되는 것으로 보고되었으나 흰점박 이꽃무지 유충에서 응집혈구세포는 관찰 할 수가 없었다. 응집 혈구세포의 일반적인 특징은 세포질이 일반적으로 맑고 투명 하며, 세포가 쉽게 부서지기 쉬우며 세포막은 어떠한 구조물이 관찰되지 않는 특징이 있다(Arnold, 1974). 응집혈구세포의 기 본적 기능은 멜라닌화 반응과 연계된 상처치료나 병원균 침입 시 식균작용도 책임지는 것으로 보고되고 있다. 많은 딱정벌레 종에서는 과립혈구세포와 세포질혈구세포가 그 기능을 대체 담당하는 것으로 보고되고 있다(Gupta, 1985). 최근 과립혈구 세포와 편도혈구세포가 흰점박이꽃무지 유충과 장수풍뎅이 (Allomyrina dichotoma) 유충에서 멜라닌화를 담당하면서 세 포성 면역에 중추적인 역할을 하는 것으로 보고하였다(Kwon et al., 2014, Hwang et al., 2015). 또한 붉은야자나무바구미 (Rhynchophorus ferrugineus)에서는 과립혈구세포와 세포질 혈구세포(Manachini et al., 2011), Cetonischema aeruginosa 유충에서는 과립혈구세포(Giulianini et al., 2003)가 그 역할을 담당하는 것으로 보고되었다. 따라서 주로 과립혈구세포가 응 집혈구세포의 기능과 중첩되거나 하여 많은 딱정벌레 종에서 응집혈구세포가 관찰 되지 않는 경향이 있는 것으로 판단된다.

투과전자현미경에 의한 혈구세포 형태적 분류

주사전자현미경은 흰점박이꽃무지 유충 혈구세포들의 외형 적 모습에 대한 정보를 제공한 반면 투과전자현미경은 구체적 으로 세포 소기관(핵, 미토콘드리아, 마이크로튜블, 세포내 발 견되는 다양한 크기의 낭리소좀)을 관찰 할 수 있었다(Fig. 2). Fig. 2A는 편도혈구세포를 나타내는데 다른 혈구세포와 비교 커다란 핵과 세포질 가지고 있는 것을 재확인 할 수 있었다. 세 포막은 주사전자현미경 결과와 같이 다양한 구조물이 관찰되 지 않는 매끈한 형태이며 세포질에는 다양한 크기의 짙은 낭들 이 관찰되었다. 일반적인 곤충의 편도혈구세포들은 리소좀이 발달 되어 있지 않는 것으로 알려져 있어서 다양한 크기 낭들은 리소좀은 아닌 것으로 판단되고 동시에 적은 수의 미토콘드리 아도 관찰 되었다(Fig. 2A). 소포체도 관찰 할 수 있었으나 그 크기와 모양을 비교하면 일반적으로 잘 발달되어 있지 않는 것 으로 판단되며 골지체는 관찰 할 수 없었다. 문헌에서도 곤충의 편도혈구세포는 소포체와 골지체를 관찰하기가 힘든 것으로 보고된바 있다(Gupta, 1985).

Fig. 2B는 과립혈구세포를 나타내는데 다른 세포와 비교하 여 매우 잘 발단된 미토콘드리아들을 발견 할 수 있다. 이는 여 섯 개의 혈구세포 중 에너지(ATP)를 가장 많이 사용하는 세포 로 추측 할 수 있었으며 소포체와 골지체도 관찰 되었다(Fig. 2B). 또한 매우 잘 발달된 다양한 크기의 낭들이 관찰 되는데 특히 짙은 색을 가지는 낭들은 다른 세포에 존재하는 낭들과 비교 주 로 세포막 주변으로 위치하고 있었으며 그 크기와 위치를 비교 하여 리소좀일 것으로 추측하였다. 일반적인 세포내 리소좀의 크기는 0.1-1.2 ㎛이고 식물세포는 녹색계통, 동물세포는 짙은 보라색 계통으로 염색이 된다. 투과전자현미경 결과 보통 짙은 색으로 관찰 되는 경우가 흔하며 곤충의 혈구세포내 리소좀은 Fig. 2B 화살표와 같은 모습으로 종종 관찰 되는 것으로 보고되 었다(Alves e Silva et al., 2013). 최근, 뱀잠자리(Oncopeltus fasciatus)의 혈구세포에서 기생자 침입시 면역혈구세포에 의 한 식균작용 후 리소좀들의 활성화가 관찰 되었고 Kwon et al. (2014)은 흰점박이꽃무지 유충의 과립혈구세포에서 리소좀의 활성화를 리소좀 마커를 사용 확인하였고 크기는 일관되지 않 으며 대략 1.2 ㎛ 이하로 보고하였다(Alves e Silva et al., 2013; Kwon et al., 2014). 또한 편도혈구세포를 포함 다른 혈구세포 들에서 관찰되는 과립들은 리소좀 마커로 염색 되지 않는 것으 로 보아 리소좀이라기보다 다른 기능을 수행하는 낭들로 판단 된다(Kwon et al., 2014). 그 외에 다른 세포에서 볼 수 없는 다 양한 크기의 투명색 낭들도 많이 관찰 되며 대체적으로 다른 세 포 비교 매우 복잡한 세포질 구조를 가지고 있음을 알 수 있었다.

Fig. 2C는 세포질혈구세포를 나타낸다. 전형적으로 긴 타원 형 형태로 비교적 커다란 핵을 가지고 있음 알 수 있었다. 여러 개의 미토콘드리아도 관찰 되나 과립혈구세포에서 관찰 되었 던 활성화 된 리소좀들은 많이 관찰 되지 않았다. Fig. 2D는 전 혈구세포를 나타내며 그 크기가 가장 작은 혈구세포이다. 전혈 구세포의 핵은 세포전체를 차지 할 정도로 그 크기가 컸으며 세 포소기관을 포함 세포질을 관찰하기가 힘들었다. 곤충 전혈구 세포의 기능은 모든 혈구세포들로 분화 될 수 있는 특징이 있는 혈구세포로서 복잡하고 다양한 세포질을 바탕으로 기능을 수 행하기 보다는 잘 발달된 핵을 이용하여 다른 기능을 가진 혈구 세포들로 분화 될 수 있는 특징을 가지고 있는 것으로 판단된다. 본 실험에서 관찰된 전혈구세포의 특징은 누에(Bombyx mori)를 비롯하여 많은 곤충에서 보고되고 있다(Yamashita and Iwabuchi, 2001). Fig. 2D는 구상적혈구세포를 나타내는데 편도혈구세포 보다는 작으며 세포막은 어떠한 구조물도 관찰 되지 않는 매끈 한 형태를 보인다. 또한 다양한 크기의 낭들도 관찰 되는데 낭 의 색깔은 과립혈구세포의 낭보다 옅은색이며 구형의 모습으 로 관찰 된다. 또한 미토콘드리아, 골지체, 소포체등도 잘 발달 되어 있지 않았다. Fig. 2E는 약간의 타원형인 지방혈구세포인 데 세포크기에 비해 핵의 크기는 작고 완전한 구형의 짙은 낭들 이 관찰 되며 주로 지방들을 함유하여 에너지를 필요로 하는 기 관에 지방을 전달하는 기능을 할 것으로 판단된다. 마지막으로 Fig. 2F는 구상적혈구세포로서 곤충에서 그 기능은 정확히 알 려져 있지 않다.

외래물질 주입에 따른 혈구세포의 형태학적 활성화

외래미생물 침입시 발생하는 흰점박이꽃무지 유충 혈구세 포의 면역학적 활성화를 관찰하기 위하여 인위적으로 세균보 다 크기가 큰 효모를 주입하였다. 주입 12시간 후 혈림프를 추 출하고 여섯 종의 혈구세포들을 투과전자현미경으로 관찰하였 다. 여섯 종의 혈구세포 중 과립혈구세포만이 효모를 식균하여 제거하는 면역학적 활성화가 관찰되었다(Fig. 3A). 효모를 식 균한 과립혈구세포는 식균된 효모에 의하여 중앙에 위치했던 원형의 핵은 타원형 형태로 가장 자리로 밀려나 있었으며 그 자 리를 효모가 위치 해 있는 것을 알 수 있었다(Fig. 3A). 과립혈 구세포의 특징 중 하나인 다양 한 크기의 짙은 리소좀들은 서로 합쳐져 있었으며 최종적으로 리소좀이 효모와 합쳐져 있는 모 습이 관찰 되었다(Fig. 3B). 세포내 리소좀은 세포내에서 강한 산성을 띠는 단일막 구조로서 주로 50종 이상의 효소들을 함유 하고 세포내 필요 없는 소기관, 단백질, 지방, 침입외래 병원균 등을 분해하는 소기관이다. Fig. 2B와 같이 면역학적으로 불활 성 상태에서는 리소좀들이 주로 세포막 주변에 산재해 있는 상 태로 존재 하다 식균작용에 의하여 세포질로 외래미생물이 세 포질에 노출 되면 여러 개의 리소좀들이 서로 합쳐지면서 최종 적으로 외래미생물과 합쳐지면서 제거하는 것을 알 수 있었다. Kwon et al. (2014)은 흰점박이꽃무지 유충을 이용하여 인위적 으로 병원균 주입 후 과립혈구세포의 면역 활성화를 다양한 염색법, 유세포 분석기(flow-cytometry), 위상차현미경(confocal microscopy) 등을 사용하여 특성을 분석하였다. 그러나 흰점박 이꽃무지 유충 과립혈구세포에 의한 외래미생물의 식균과 상 태를 정확히 제시한 결과는 없었으며 특히, 리소좀과 외부미생 물과의 합쳐지는 현상은 척추동물을 포함하여 쉽게 관찰하지 못하는 결과이다. 본 논문의 연구 결과는 우리나라 주요 농·산 업곤충인 흰점박이꽃무지 유충의 혈강내 존재하는 혈구세포들 의 종류와 형태적 특성을 제시하고 특히 과립혈구세포가 외부 미생물들과 대항하는 주요 혈구세포임을 알 수 있었다. 또한 과 립혈구세포의 세포질은 매우 잘 발달되어 있었으며 특히 발달 된 리소좀은 외래미생물 제거에 중추적 역할을 담당하는 것으 로 판단된다.