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ISSN : 1225-0171(Print)
ISSN : 2287-545X(Online)
Korean Journal of Applied Entomology Vol.55 No.3 pp.245-256
DOI : https://doi.org/10.5656/KSAE.2016.06.0.017

Differentiation of Elytra Color Patterns in Multicolored Asian Ladybird Beetle, Harmonia axyridis (Coleoptera; Coccinellidae), using AFLP analyses

Cho Rong Park, Jeong Hee Kim, Yong Man Yu, Young Nam Youn*
Department of Agricultural Biology, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea
Corresponding author:youngnam@cnu.ac.kr
March 3, 2016 June 7, 2016 June 23, 2016

Abstract

Elytra of Harmonia axyridis exhibit varied color patterns. In the present study, we deciphered the genetic basis for intraspecific diversity of elytra color patterns in H. axyridis, using amplified fragment length polymorphism (AFLP). Twenty-eight AFLP reactions were performed to generate a total of 2,741 bands. Of these, 20 bands were polymorphic for each color pattern. The polymorphic bands showed differences of genetic character among different color patterns of H. axyridis. Among them, ten candidate AFLP markers were color-linked. S1, S2, and S20 markers were detected in Succinea 1 and 2 variants of H. axyridis, whereas S3 and S5 were specifically detected in the Conspicua variant. S15, S18, and S19 were specific to the Succinea 2 variant. Polymerase chain reaction (PCR) products of these ten AFLP markers were sequenced. BLAST analysis of these sequences against the GenBank database revealed their homology to DNA fragments of unknown function. Based on the color-linked AFLP markers, sequence characterized amplified region (SCAR) markers were designed for PCR amplification of genomic DNA. Of the ten AFLP markers, five were successfully converted into SCAR markers, which could discriminate elytra color polymorphism in H. axyridis.

AFLP , Harmonia axyridis , Elytra Color Pattern , Differentiation

Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)을 이용한 무당벌레(Harmonia axyridis : Coccinellidae)의 초시색상패턴의 변이 분석

박 초롱, 김 정희, 유 용만, 윤 영남*
충남대학교 농업생명과학대학 응용생물학과

초록

무당벌레(Harmonia axyridis)는 종내에서 초시색상패턴이 매우 다양하게 존재한다. 본 논문에서는 서로 다른 색상패턴의 무당벌레를 대상 으로 amplified fragment length polymorphism (AFLP)을 실시하여 무당벌레의 초시색상 패턴간 유전형질의 차이를 확인하고자 하였다. 총 28 개의 프라이머 조합으로 실험을 실시한 결과, 총 2,741 개의 밴드가 검출되었다. 그 중 20 개의 밴드(S1-S20)만이 특정 색상패턴에서 나타났 다. 이들 가운데 9 개의 밴드를 색상에 연관된 AFLP 후보 지표로 선발하였다. 밴드 가운데 S1과 S2, S20은 Succinea 1, 2 변이형에 공통적으로 나타났으며, S3와 S5는 Conspicua 변이형에 특이적이었다. 또한 S13는 Spectabilis 변이형에, S15와 S18, S19는 Succinea 2 변이형에 특이적 이었다. 특정 색상패턴에만 나타나는 9 개의 AFLP 지표들은 cloning을 통해 염기서열 분석을 실시하였고, GenBank를 이용해 다른 염기 서열 과 비교를 해보았지만 아무런 상동성도 찾을 수가 없었다. 무당벌레 종 내 유전적 다양성을 평가한 결과, Spectabilis가 Conspicua보다 Succinea 변이형에 높은 유사성을 보였다. 색상에 연관된 AFLP 후보 지표를 기준으로 sequence characterized amplified region (SCAR) 지 표로 변환하여 9 개의 AFLP 분자지표들 가운데에서 5 개만이 SCAR 지표로 전환될 수 있었으며, 이를 통해 AFLP 지표가 무당벌레의 색상과 연관되어 있는지 확인할 수 있었다.

AFLP , 무당벌레 , 초시색상 , 변이
    Chungnam National University

    무당벌레(Harmonia axyridis Pallas)는 딱정벌레목(Coleoptera) 무당벌레과(Coccinellidae)에 속하는 곤충으로 국내에서는 우 리들 생활주변에서 가장 흔히 볼 수 있는 곤충 종 중의 하나이 다. 무당벌레가 속해있는 무당벌레과에는 전 세계적으로 약 490속 4,200여 종이 기록되어 있으며(Iperti, 1999), 이들 가운 데 현재 국내에는 74종이 보고되고 있고(ESK and KSAE, 1994), 북미대륙에는 400여종(Belicek, 1976), 유럽에는 110종이 분 포하고 있는 것으로 보고되고 있다(Iperti, 1986). 무당벌레과 중에서 무당벌레는 한국, 일본, 대만, 중국 및 사할린을 비롯한 극동 시베리아 및 아시아에 분포하는 토착종으로(Brown et al., 2008; Dobzhansky, 1933; Kuznetsov, 1997; Park, 1993) 전세 계에 걸쳐 분포하고 있는 것으로 보고되어 있다(Brown and Miller, 1998; Chapin and Brou, 1991; Day et al., 1994; Kidd et al., 1995; Lamana and Miller, 1998; Nalepa et al., 1996; Seo et al., 2007; Tedders and Schaefer, 1994). 무당벌레는 진딧물을 포식하는 주요 천적일 뿐 아니라 깍지벌레, 온실가루이 등을 포 함한 여러 해충들을 포식하므로 해충의 생물적 방제에 활용 가 능성이 매우 높은 곤충 종으로 오래 전부터 각광받고 있다(Hagen, 1962; Hodek, 1973; Koch, 2003; Majerus, 1994; Roy and Wajnberg, 2008; Seo and Youn, 2000; Sweetman, 1958; Youn et al., 2003). 실제로 진딧물 개체군 밀도 억제측면에서의 무당 벌레의 포식활동은 매우 넓어 다른 포식성 곤충이나 기생성 천 적들과 비교했을 때 상대적으로 높은 위치를 차지하는 것으로 평가되며(Obata, 1986), 특히 유충과 성충이 모두 진딧물을 비롯 한 여러 해충들을 포식한다는 사실은 무당벌레가 천적자원으로 서 가치가 높음을 확인 시켜준다 (Seo, 1999; Seo and Youn, 2000).

    무당벌레는 생물적방제인자로서 중요한 면을 가지고 있지 만, 무당벌레 초시에 나타나는 색상과 무늬의 변이가 매우 다양 하여 관심의 대상이 되고 있다(Seo et al., 2007). Komai (1956)는 무당벌레를 초시색상패턴에 따라 Succinea, Conspicua, Spectabilis, Axyridis 변이형의 4가지 그룹으로 나누어 보고한 바 있었는데, 이를 Seo et al. (2007)이 초시에 있는 점의 개수에 따라 Succinea 변이형을 Succinea 1, Succinea 2 변이형으로 나누어 보고하였 다. 또한 Tan and Li (1934)에 의해 무당벌레의 초시색상패턴 은 유전적으로 분석된다고 보고되었고, Komai et al. (1950)에 의해 초시색상 변이는 무당벌레의 지리적 분포뿐만 아니라 온 도에 의해서도 달라질 수 있다고 보고되었다. 또한 Stewart and Dixon (1989)에 의해서 melanin 색상 선택의 주요 원인이 태양 에너지라고 보고되었고, Seo et al. (2008)은 무당벌레가 교미 시 멜라닌 그룹(Conspicua 변이형)을 더 선호하고, 패턴 별로 수컷에서 충체 크기가 다르다고 보고한 바 있다. 이렇듯 초시색 상의 다형현상에 대한 연구가 이루어져 왔으나, 아직까지 무당 벌레가 가지고 있는 색상변이의 실제적인 원인이 무엇인지는 밝혀지지 않고 있다.

    유전적 다양성을 분석하는 기술 중 amplified fragment length polymorphism (AFLP) 기술은 간편한 분석법과 높은 재현성을 바탕으로 유전자 표지를 발굴하기 위한 연구방법이다(Jones et al., 1997; Li et al., 2006; Mackill et al., 1996; Vos et al., 1995). 본 기술은 유전적 유사도가 가까운 종이나 품종 간에도 고도의 유전적 변이 및 다형현상 검출, 한번에 많은 유전자 좌위(locus) 를 검색, 시료의 수가 제한된 경우에도 많은 유전적 변이 검출 등의 다양한 장점을 가지고 있어 유전자 다양성 분석, 잡종 판 별, 표현형 관련 분자지표 탐색, 집단구조 분석에 매우 유용하 다고 알려져 있다(Blears et al., 1998; Bonin et al., 2007; Knorr et al., 1999; Mariette et al., 2001; Roa et al., 1997; Wichan et al., 2000; Xiao et al., 2009; Xu et al., 2006; Yeon et al., 2008). 이미 Hawaiian cricket (Parsons and Shaw, 2001)과 쇠똥구리 (Carisio et al., 2004)의 형태적인 차이를 규명하고, Colorado potato beetle (Hawthorne, 2001)에서 Pyrethroid 저항성 후보 유 전자와 성염색체를 발견하였으며, 유채의 주요 해충인 Meligethes aeneus (Kazachkova et al., 2004, 2007)와 저장해충인 Tribolium castaneum (Zhong et al., 2004)의 유전자형을 확인하고, Heliconius Melpomene (Jiggins et al., 2005)에서 색상패턴에 관련된 유전 자를 탐색하는 등 AFLP 기술을 활용한바 있다.

    본 연구는 AFLP를 통해 무당벌레의 초시색상패턴 사이의 유전형질의 차이를 확인하고 sequence-characterized amplified region (SCAR) 분자지표로 변환을 시도하였다.

    재료 및 방법

    무당벌레

    무당벌레는 월동처로 날아온 월동 개체군을 채집하여 직경 15 cm인 플라스틱 Petri dish에 30-40여 마리씩 낙엽과 함께 넣 어 나무상자에 모아 10℃ 인큐베이터에서 다음해 봄까지 월동 시키고, 3월에 나무상자에서 꺼내어 인공먹이를 제공하여 15℃ 인큐베이터에 사육하면서 사용하였다. 각 색상패턴에 특이적 인 AFLP 밴드를 확인하고 색상패턴에 특이적인 AFLP 증폭조 각이 SCAR 분자지표로 변환이 되었는지 확인하기 위하여, 무 당벌레들 가운데서 Succinea 1 (YBM19), Succinea 2 (YBM00), Conspicua (BRA02), Spectabilis (BRA04) 등 4가지 변이형 색 상패턴에서 각각 암컷, 수컷 2마리씩 4마리씩을 선발하여 실험 을 실시하였다.

    DNA 추출

    전체 게놈 DNA는 cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) 방법(Moeller et al., 1992)을 변형하여 추출하였다. 색상패턴별 무당벌레를 각각 한 마리씩 막자사발에 넣은 후 0.25~0.55 mM 크기의 유리구슬을 넣고 액체질소를 부어 동결건조 시키며 마 쇄봉으로 마쇄하였다. 마쇄된 시료는 각각 1.5 ml 튜브에 넣고 extraction 완충용액 (200 mM Tris-HCl[pH 8.0], 200 mM NaCl, 30 mM EDTA, 0.5% SDS) 400 ㎕에 현탁해 proteinase K 5 ㎕ 를 첨가, 37℃에 1시간 동안 반응시켰다. 여기에 2% CTAB 완 충용액(2% CTAB[w/v], 0.1 M Tris-HCl[pH 8.0], 0.02 M EDTA[pH 8.0], 1.4 M NaCl, 0.5% β-mercaptoethanol) 400 ㎕ 를 첨가하여 잘 섞어준 뒤, 700 ㎕의 Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25: 24: 1)을 첨가하여 13,000 rpm으로 10분 간 원심분리 하여 얻은 상층액을 깨끗한 1.5 ml 튜브에 옮겼다. 이 과정을 한차례 반복한 뒤, 0.7 배 부피의 isopropanol을 첨가 하여 실온에 10분간 두었다가 4℃ 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 게놈 DNA가 침전되면 상층액은 버리고 500 ㎕의 70% 에탄올을 첨가하여 DNA를 세척한 후 같은 조건에 서 원심분리하였다. 다시 상층액을 버리고 세척이 끝난 DNA 는 진공펌프로 30분 이상 건조시킨 후, 멸균된 3차 증류수를 첨 가하여 DNA를 용해시키고 RNase를 첨가해 1시간 동안 37℃ 에 반응시켰다. 이렇게 하여 추출된 게놈 DNA는 1.2% 아가로 스젤에 전기영동으로 확인한 후, -20℃에 보관하였다.

    AFLP 분석

    AFLP는 Vos et al. (1995)의 방법을 변형시켜 4단계로 실험 하였다.

    게놈 DNA 단편화와 어댑터 부착

    각각 시료의 게놈 DNA(200 ng)는 전체 부피 25 ㎕에 10 × NEBuffer 완충용액에서 7.5 U EcoR I (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)을 첨가해 37℃에서 12 시간 동안 반응시 켰다. 잘려진 DNA는 몇 단계의 세척과정을 거친 뒤, 10 ㎕의 멸균된 3차 증류수에 다시 용해되었다. EcoR I에 의해 잘려진 DNA는 전체 부피 20 ㎕에 10 × NE 완충용액 # 2에서 10 U Mse I(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)을 첨가해 3 7℃에서 12 시간 반응시켰다. 잘려진 DNA는 또 다시 몇 단계 의 세척과정을 거친 뒤, 10 ㎕ 멸균된 3차 증류수에 용해되었 다. 여기에 5 pmol EcoR I adapter와 50 pmol Mse I adapter, 175U T4 DNA ligase(Takara Bio Inc., Otsu, Japan), 2 ㎕의 10 × T4 ligase 완충용액을 첨가하여 전체용량을 20.5 ㎕로 만들 어 16℃에서 12시간 반응시켜 EcoR I과 Mse I에 의해 잘린 DNA의 말단에 각각의 어댑터를 부착시켰다. 실험에 사용된 프라이머 서열은 Table 1에 나타내었다.

    AFLP의 1차 증폭과정

    AFLP의 1차 증폭과정은 4 ㎕ ligated DNA, 5 ㎕ 10×Ex Taq 완충용액, 250 μM dNTP mixture, 25 pmol Eco+0 프라이머(5' →3': GACTGCGTACCAATTC) 25 pmol Mse+0 프라이머 (5' →3': GATGAGTCCTGAGTAA), 5 ㎕ 0.01% bovine serum albumin (BSA), 2.5 U Ex Taq (Takara)를 넣어 전체용량을 50 ㎕ 로 조정한 후 1차 증폭과정을 실시하였다. PCR 반응조건은 94℃ 에서 30 초, 56℃에서 60 초, 72℃에서 60 초를 1 주기로 총 20회 반복하였다.

    AFLP 2차 증폭과정

    증폭된 산물은 멸균된 3차 증류수로 1:5로 희석하여 2차 증 폭과정을 실시하였다. 희석된 1 ㎕의 1차 증폭물, 2.5 ㎕ 10×Ex Taq 완충용액, 25 pmol Mse+3 프라이머, 25 pmol Eco+3 프라 이머, 250 μM dNTP, 2.5 ㎕ 0.01% BSA, 1.25U Ex Taq (Takara)을 넣어 전체용량을 25 ㎕으로 만들어 PCR을 수행하 였다. PCR 반응조건은 처음 94℃에서 30초간 변성시켰으며, touchdown PCR법을 이용하여 64℃에서 30초(회당 0.7℃감 소), 72℃에서 60초간 12 주기를 실시 후 94℃에서 30초, 56℃ 에서 30초, 72℃에서 60초로 고정하여 총 23회 반복하였다. 총 28 개의 프라이머 조합으로 실험을 실시하였다.

    전기영동과 실버염색법

    선별 증폭을 마친 PCR 증폭물에 6 ㎕ loading dye(40% Sucrose, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene cyanol)을 첨가하여 95℃에서 2분간 변성시킨 후 얼음에 보관했다. 그 중 4 ㎕를 1 × TBE 완충용액 [pH 8.0]에서 6% 폴리아크릴아마이 드젤에 2,100 로 4시간 30분 동안 전기영동하여 DNA 증폭물 을 분리시킨 후, Silverstar ® Staining System (Bioneer Crop., Daejeon, Korea)을 사용하여 현상하였다. 현상한 겔은 건조시 켜 사진을 기록한 후, 결과를 분석하였다.

    색상 특이적 AFLP 증폭물의 염기서열 분석

    특정한 밴드는 razor blade를 이용하여 polyacrylamide gels 에서 오려냈다. DNA 증폭물을 포함하고 있는 잘라낸 겔 조각 은 1.5 ml 튜브에 30 ㎕의 멸균된 3차 증류수와 함께 넣어줬다. Pipette tip으로 겔 조각을 부숴주듯이 섞은 뒤, 상온에서 밤샘 시켜 95℃에서 10 분간 끓였다. 튜브는 10,000 rpm에 5분간 원 심분리한 뒤, 4 ㎕의 상층액은 2차 증폭과정에서와 같은 프라 이머 조합으로 재증폭하였는데 그 조건은 5 ㎕ 10×Ex Taq 완 충용액, 25 pmol Eco+3 프라이머, 25 pmol Mse+3 프라이머, 5 ㎕ 0.01% BSA, 2.5U Ex Taq (Takara)를 넣어 전체 부피 50 ㎕ 로 맞추고 94℃에서 30 초, 56℃에서 1 분, 72℃에서 1 분의 주 기로 총 20회 반복하여 실시하였다. 재증폭된 산물은 1.2% 아 가로스젤에 전기영동하여 확인하였다.

    Wizard Ⓡ SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, Wl, USA)로 정제한 후, 마크로젠(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 sequencing을 수행하였다. 염기서열 정렬은 Chromas 145-95 program, PHYDIT program을 이용하였고, 색상패턴에 특이적인 증폭조각의 염기서열 데이터는 GenBank (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)의 BLAST searching을 이용 하여 기존에 알려진 유전자 염기서열과 유사성이 있는지를 확 인하였다.

    계통수 분석

    무당벌레의 4가지 주요 색상패턴(YBM19, YBM00, BRA02, BRA04)의 암컷 2마리씩을 임의로 선발하였다. 실험 충들의 DNA 추출 후, 앞에서 실시한 AFLP 실험에서 특이적 밴드를 가장 많이 생산한 3 개의 프라이머 조합으로 AFLP를 진행하여 Gelcompar II version 2.0을 사용하여 계통수를 분석하였다.

    SCAR 분자지표 디자인과 PCR 분석

    색상패턴에 특이적인 AFLP 증폭조각의 염기서열 정보를 기초로 프라이머 3 software (http://www.bioneer.co.kr/tools/) 를 사용하여 Oligonucleotide 프라이머는 디자인되었고, 합성 되었다. 색상패턴에 특이적인 AFLP 증폭물이 SCAR 분자지표 로 변환되었는지 확인하기 위하여 표준 PCR을 실시하였고, protocol은 1 ㎕의 게놈 DNA, 2 ㎕ 10 × Ex Taq 완충용액, 10 pmol 프라이머, 2.5 mM dNTP, 1U i-Taq Plus DNA Polymerase (Intron, Seongnam, Gyeonggi, Korea)을 넣어 전체 용량을 25 ㎕ 로 맞추고, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초를 1주기로 30회 반복으로 수행하였다. 각 PCR 생성물의 4 ㎕는 cloned AFLP 분자지표가 SCAR 분자지표로 성공적으로 전환 되었는지 여부를 확인하기 위해 전기영동을 실시하였다.

    결과 및 고찰

    패턴별 차별적인 AFLP 증폭조각 확인

    무당벌레의 대표적인 초시색상패턴인 Succinea 1, Succinea 2, Conspicua, Spectabilis 변이형 그룹의 암컷과 수컷 2마리씩, 패턴당 4마리의 DNA를 추출하여 총 28 개의 프라이머 조합으 로 AFLP를 실시하였다. 총 28 개의 프라이머 조합을 실시한 결 과 20 개의 DNA 증폭조각이 다른 색상패턴에서는 나타나지 않고 오직 한 개나 두 개의 색상패턴에만 특이적으로 나타났다. AFLP는 제한효소의 인지부위와 3’ 말단부위에 추가 염기서열 의 G와 C 조성 및 프라이머의 조합형에 따라 크게 좌우되며 일 반적으로 적절한 프라이머, 제한효소의 선발에 의해 약 50-100 개의 특이적 밴드를 생성해 낼 수 있다고 알려져 있다(Aarts et al., 1998; Reineke and Karlovsky, 2000; Rusell et al., 1997). 총 28 개의 선발된 프라이머 조합에서 총2,741 개의 특이적 밴 드가 검출되었으며(Table 2), 각 프라이머 조합당 약 97.89 개 의 특이적 밴드가 탐색되어 제한효소 및 프라이머 조합이 적절 히 이용되었고, 무당벌레의 집단 내 초시색상패턴 확인에 효과 적으로 적용되었음을 알 수 있었다. AFLP를 통해 얻은 패턴별 차이를 나타내는 밴드를 생성해낸 프라이머 조합은 28 개 중 8 개로 나타났다. 전체 밴드 중에서 다형현상을 나타내는 밴드의 선발은 육안 구별이 명확하고 염색의 강도가 대략 30% 이상 나 타난 밴드를 기본으로 하여, 특정 초시색상패턴에서는 나타나 지만 다른 초시색상패턴에서는 나타나지 않는 밴드를 분자지 표로 선발하였다. 그 결과 각 색상패턴에 독특한 밴드는 총20 개가 나왔다(Table 3). 그 중 2 개는 Succinea 1 변이형에, 7 개 는 Succinea 2 변이형에, 4 개는 Conspicua 변이형에, 3 개는 Spectabilis 변이형에 특이적이었고, 4 개는 Succinea 1과 2변 이형에 특이적이었다.

    후보 AFLP 분자지표의 초시색상패턴 관련 확인

    후보 AFLP 분자지표가 무당벌레의 초시색상패턴과 관련이 있는지를 확인하기 위해 AFLP의 차별적인 밴드를 가지고 실 험을 실시하였다. 월동개체군 내에서 패턴별로 암컷 5 마리, 수 컷 5 마리씩 10 마리를 선발하여 DNA를 추출한 뒤 실험에 사 용하였다. 70% 이상 다시 나타난 AFLP 밴드는 초시색상과 관 련이 있는 후보 분자지표로 간주하였다(Table 3). S1, S2는 Eco+ ACA/Mse+CTG의 프라이머 조합으로 실시한 것으로 474 bp 와 120 bp로 이루어져있으며, 둘 다 Succinea 1과 2 변이형에 80%의 재현성을 보였고, S4는 S1, S2와 같은 프라이머 조합으 로 실시되었으며 267 bp로 이루어져있고 Conspicua 변이형에 60%의 재현성을 나타내 후보 분자지표에서 제외시켰다. S3은 Eco+ACA/Mse+CTA의 프라이머 조합으로 실시한 것으로 505 bp로 이루어져있으며 Conspicua 변이형에 70%의 재현성 을 보였다. S18, S19도 역시 S3과 같은 프라이머 조합으로 실시 됐고 401 bp, 408 bp로 Succinea 2 변이형에 80%, 90% 재현성을 나타냈다. S20 역시 같은 프라이머 조합이며 292 bp, Succinea 1 과 2 변이형에 80% 재현성을 나타냈다. S5, S15는 Eco+ACC/Mse+ CTG의 프라이머 조합으로 실시되었고, 각각 290 bp, 299 bp로 Conspicua 변이형(100%)과 Succinea 2 변이형(70%)에 재현 성을 나타냈다. S13은 Eco+ACT/Mse+CTT의 프라이머 조합 으로 실시하였고, 256 bp로 Spectabilis 변이형에 90%의 재현 성을 나타냈다.

    무당벌레 초시 다형집단의 유전적 거리

    다른 AFLP자료들로 보아 무당벌레의 종내에 유전적 다 양성이 존재하고 있다는 것을 유추할 수 있다. 본 실험에서 는 28 개의 프라이머 조합으로 실험을 실시하였는데, 이중 3 개의 조합이 유전적 거리 계산에 사용되었다. Jaccard 상수 ( J ( A ,   B ) = | A ∩ B | | A ∪ B | = | A ∩ B | | A | + | B | − | A ∩ B | ) 를 사용하여 genetic diversity estimates (GDEs) 값을 구하였고(Table 4), 이를 토대 로 unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) 으로 변환하였다(Fig. 1). GDE 자료를 보면 같은 비암화형인 Succinea 1과 Succinea 2 변이형의 GDE 값이 0.07로 가장 유사 한 것을 볼 수 있다. Conspicua와 Succinea 1 변이형의 GDE값 은 0.36이고 Conspicua와 Succinea 2 변이형은 0.37인 반면에 Spectabilis와 Succinea 1 변이형의 GDE값은 0.28이고 Spectabilis 와 Succinea 2 변이형의 GDE 값은 0.31이었다. Conspicua와 Spectabilis 변이형의 GDE값은 0.38로 가장 큰 차이를 나타내 었다. 이로써 Spectabilis 변이형이 Conspicua 변이형보다 좀더 Succinea 1과 Succinea 2 변이형에 유사성을 보이는 것을 알 수 있었다. 또한 Conspicua 변이형은 검은색 바탕에 황색 또는 붉 은색 점을 2 개 가지고 있는 표현형으로 형태적으로는 검은색 바탕에 황색 또는 붉은색 점을 4 개 가지고 있는 Spectabilis 변 이형과 유사하지만, GDE값으로 미루어 볼 때 유전학적인 유사 성은 Succinea 변이형에 좀 더 가깝다는 것을 확인할 수 있었다.

    염기서열 분석과 SCAR 분자지표 변환

    AFLP를 통해 얻은 패턴별로 차이를 나타내는 밴드 20 개 중 10 개만이 염기서열이 분석되었다(Fig. 2). 염기서열 분석이 완 료된 것은 GenBank BLAST searching을 통해 기존에 알려진 염기서열과 유사성을 검색하였다. 그 결과 지브라피쉬, 박테리 아 등과 유사성을 보였으나, 그 기능은 확인되지 않았다. 염기 서열분석이 완료된 10 개의 밴드는 염기서열을 기초로 SCAR 분자지표를 디자인하였다(Table 5).

    후보 AFLP 분자지표가 SCAR 분자지표로 성공적으로 변환 되었는지를 확인하기 위해 다른 DNA 시료를 이용하여 확인하 였다. 여기에 쓰인 DNA 시료는 각 색상패턴의 암컷 3 마리의 독립적인 개체를 사용하였다. 그 결과, 10 개 중 S1을 포함한 S3, S13, S18, S19 등 5 개만이 변환된 SCAR 분자지표가 특이 적인 색상패턴에 선택적으로 증폭됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

    감사의 글

    본 연구는 2015년도 충남대학교 자체연구비에 의하여 수행 되었으며 이에 감사를 드립니다.

    KSAE-55-245_F1.gif

    Unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) cluster analysis of AFLP profiles generated by three primer combinations for H. axyridis.

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    Nucleotide sequences and GenBank accession numbers of ten AFLP bands designated as S1, S2, S3, S4, S5, S13, S15, S18, S19, and S20.

    KSAE-55-245_F3.gif

    Agarose gel electrophoresis of products amplified using SCAR markers, (A) S1, (B) S3, (C) S13, (D) S18, and (E) S19.

    Sequences of AFLP primers and their combinations used in the study

    *The sequence of EcoR I primer was 5′-GACTGCGTACCAATTC-3′, and of Mse I primer was 5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′.

    Number of unique molecular marker bands specific for each elytra color patterns of H. axyridis

    Color pattern-specific AFLP markers in H. axyridis

    Means of AFLP-based pair-wise genetic diversity estimates (GDEs) among the H. axyridis variants using three primer combinations

    Nucleotide sequence of the SCAR primers designed to amplify AFLP markers

    Reference

    1. Aarts HJ , van Lith LA , Keijer J (1998) High resolution genotyping of Salmonella strains by AFLP-fingerprinting , Lett. Appl. Microbiol, Vol.26 ; pp.131-135
    2. Belicek J (1976) Coccinellidae of Western Canada and Alaska with analyses of the transmontane zoogeographic relationship between the fauna of British Columbia and Alberta , Questiones Entomol, Vol.12 ; pp.283-409
    3. Blears MJ , de Grandis SA , Lee H , Trevors JT (1998) Amplified fragment length polymorphism (AFLP): A review of the procedure and its applications , J. Ind. Microbiol. Biotechnol, Vol.21 ; pp.99-114
    4. Bonin A , Ehric D , Manel S (2007) Statistical analysis of amplified fragment length polymorphism data: a toolbox for molecular ecologists and evolutionists , Mol. Ecol, Vol.16 ; pp.3737-3758
    5. Brown MW , Miller SS (1998) Coccinellidae (Coleoptera) in apple orchards of eastern West Virginia and the impact of invasion by Harmonia axyridis , Entomol. News, Vol.109 ; pp.136-142
    6. Brown PMJ , Roy HE , Rothery P , Roy DB , Ware RL , Majerus MEN (2008) Harmonia axyridis in Great Britain: Analysis of the spread and distribution of a non-native Coccinellidae , BioControl, Vol.53 ; pp.55-67
    7. Carisio L , Cervella P , Palestrini C , Delpero M , Rolando A (2004) Biogeographically patterns of genetic differentiation in dung beetles of the genus Trypocopris (Coleoptera, Geotrupidae) inferred from mtDNA and AFLP analyses , J. Biogeography, Vol.31 ; pp.1149-1162
    8. Chapin JB , Brov VA (1991) Harmonia axyridis (Pallas): the third species of the genus to be found in the United States (Coleoptera: Coccinellidae) , Proc. Entomol. Soc. Wash, Vol.93 ; pp.630-635
    9. Day WH , Prokrym DR , Ellis DR , Chianer RJ (1994) The known distribution of the predator Propylea quatuordecimpunctata (Coleoptera: Coccinellidae) in the United States, and thoughts on the origin of this species and five other exotic lady beetles in Eastern North America , Entomol. News, Vol.105 ; pp.244-256
    10. Dobzhansky T (1933) Geographical variation in ladybeetles , Am. Nat, Vol.67 ; pp.97-126
    11. ESK and KSAE (1994) Check list of insects from Korea (eds), Kon-Kuk Univ. Press,
    12. Hagen KS (1962) Biology and ecology of predaceous Coccinellidae , Ann. Rev. Entomol, Vol.7 ; pp.289-326
    13. Hawthorne DJ (2001) AFLP-based genetic linkage map of the Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata: Sex chromosomes and a pyrethroid-resistance candidate gene , Genetics, Vol.158 ; pp.695-700
    14. Hodek I (1973) Biology of Coccinellidae , Acad. Sci. Prague,
    15. Iperti G (1986) Les coccinellidae de France , Phytoma, Vol.377 ; pp.14-22
    16. Iperti G (1999) Biodiversity of predacious Coccinellidae in relation to bioindication and economic importance , Agricul. Ecosys. Environ, Vol.74 ; pp.323-342
    17. Jiggins CD , Mavarez J , Beltran M , McMillan WO , Johnston JS , Bermingham E (2005) A genetic linkage map of the mimetic butterfly Heliconius melpomene , Genetics, Vol.171 ; pp.557-570
    18. Jones CJ , Edwards KJ , Castaglione S (1997) Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories , Mol. Breed, Vol.3 ; pp.381-390
    19. Kazachkova N , Fahleson J , Meijer J (2004) Establishment of the amplified fragment length polymorphism (AFLP) technique for genotyping of pollen beetle (Meligethes aeneus)- A noxious insect pest on oilseed rate (Brassica napus) , Mol. Biol. Rep, Vol.31 ; pp.37-42
    20. Kazachkova N , Meijer J , Exbom B (2007) Genetic diversity in pollen beetles (Meligethes aeneus) in Sweden: Role of spatial, temporal and insecticide resistance factors , Agricul. For. Entomol, Vol.9 ; pp.259-269
    21. Kidd KA , Nalepa CA , Day ER , Waldvogel MG (1995) Distribution of Harmonia axyridis (Pallas) (Coleoptera: Coccinellidae) in North Carolina and Virginia , Proc. Entomol. Soc. Wash, Vol.97 ; pp.729-731
    22. Knorr C , Cheng HH , Dodgson JB (1999) Application of AFLP markers to genome mapping in poultry , Anim. Genet, Vol.30 ; pp.28-35
    23. Koch RL (2003) The multicolored Asian ladybeetle, Harmonia axyridis: a review of its biology, uses in biological control, and non-target impacts , J. Insect Sci, Vol.3 ; pp.1-16
    24. Komai T (1956) Genetics of ladybeetles , Adv. Genetics, Vol.8 ; pp.155-189
    25. Komai T , Chino M , Hosino Y (1950) Contributions to the evolutionary genetics of the lady-beetle, Harmonia I Geographic and temporal variations in the relative frequencies of the elytral pattern types and in the frequency of elytral ridge , Genetics, Vol.35 ; pp.589-601
    26. Kuznetsov VN (1997) Lady beetles of Russian Far East, The Sandhill Crane Press,
    27. Lamana ML , Miller JC (1998) Temperature dependent development in an Oregon population of Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae) , Environ. Entomol, Vol.27 ; pp.1001-1005
    28. Li Z , Li J , Wang Q , He Y , Liu P (2006) The effects of selective breeding on the genetic structure of shrimp Fenneropenaeus chinensis populations , Aquacul, Vol.258 ; pp.278-282
    29. Mackill DJ , Zhang Z , Renona ED , Colowit PM (1996) Level of polymorphism and genetic mapping of AFLP markers in rice , Genome, Vol.39 ; pp.969-977
    30. Majerus MEN (1994) Ladybirds, Harper Collins Publishers,
    31. Mariette S , Chagne D , Lezier C , Pastuszka P , Raffin A , Plomion C , Kremer A (2001) Genetic diversity within and among Pinus pinaster populations: comparison between AFLP and microsatellite marker , Heredity, Vol.86 ; pp.469-479
    32. Moeller EM , Bahnweg G , Sandermann H , Geiger HH (1992) A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi fruit bodies, and infected plant tissues , Nucleic Acids Res, Vol.20 ; pp.6115-6116
    33. Nalepa CA , Kidd KA , Ahlstron KR (1996) Biology of Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae) in winter aggregations , Ann. Entomol. Soc. Am, Vol.89 ; pp.681-685
    34. Obata S (1986) Mechanisms of prey finding in the aphidophagous ladybird beetle, Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae) , Entomophaga, Vol.31 ; pp.303-311
    35. Park HC (1993) Systematics and ecology of Coccinellidae (Insecta: Coleoptera) in Korea. PhD Thesis, Korea Univ,
    36. Parsons YM , Shaw KL (2001) Species boundaries and genetic diversity among Hawaiian crickets of the genus Laupala identified using amplified fragment length polymorphism , Mol. Ecol, Vol.10 ; pp.1765-1772
    37. Reineke A , Karlovsky P (2000) Simplified AFLP protocol: replacement of primer labeling by the incorporation of alpha-labeled nucleotides during PCR , Biotechniques, Vol.28 ; pp.622-623
    38. Roa AC , Maya MM , Duque MC , Tohme J , Allem AF , Bonierbale MW (1997) AFLP analysis of relationships among cassava and other Manihot species , Theor. Appl. Genet, Vol.95 ; pp.741-746
    39. Roy H , Wajnberg E (2008) From biological control to invasion: The ladybird Harmonia axyridis as a model species , BioControl, Vol.53 ; pp.1-4
    40. Rusell J R , Fuller JD , Macaulay M , Hatz BG , Jahoor A , Powell W , Waugh R (1997) Direct comparison of levels of genetic variation among barley accessions detected by RFLPs, AFLPs, SSRs, and RAPDs , Theor. Appl. Genet, Vol.95 ; pp.714-722
    41. Seo MJ (1999) Behavioral characteristics and effective control strategies to aphids with the Asian Ladybird Beetle, Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae). Ms. Thesis, Chungnam Nat’l Univ, ; pp.68
    42. Seo MJ , Kang EJ , Kang MK , Lee HJ , Seok HB , Lee DH , Park SN , Yu YM , Youn YN (2007) Phenotypic variation and genetic correlation of elytra colored patterns of multicolored Asian lady beetles, Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae) in Korea , Korean J. Appl. Entomol, Vol.46 ; pp.235-249
    43. Seo MJ , Kim GH , Youn YN (2008) Differences in biological and behavioural characteristics of Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae) according to colour patterns of elytra , J. Appl. Entomol, Vol.132 ; pp.239-247
    44. Seo MJ , Youn YN (2000) The Asian Ladybird, Harmonia axyridis, as biological control agent: I Predacious behavior and feeding ability , Kor. J. Appl. Entomol, Vol.39 ; pp.50-71
    45. Stewart LA , Dixon AFG (1989) Why big species of ladybird beetles are not melanic , Functional Ecol, Vol.3 ; pp.165-171
    46. Sweetman HL (1958) The principle of biological control, Brown WC,
    47. Tan CC , Li JC (1934) Inheritance of the elytral color patterns of the ladybird beetle, Harmonia axyridis Pallas , Genetics, Vol.68 ; pp.252-265
    48. Tedders WL , Schaefer PW (1994) Release and establishment of Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae) in the Southeastern United States , Entomol. News, Vol.105 ; pp.228- 243
    49. Vos P , Hodgers R , Bleeker M , Reijans M , van de Lee T , Hornes M , Frijters A , Pot J , Peleman J , Kuiper M , Zabeau M (1995) AFLP, a new technique for DNA fingerprinting , Nucl. Acids. Res, Vol.23 ; pp.4407-4414
    50. Wichan E , Yonemori K , Kanzaki S (2000) Amplified fragment length polymorphism analysis for studying genetic relationships among Mangifera species in Thailand , J. Am. Soc. Hortic. Sci, Vol.125 ; pp.160-164
    51. Xiao JP , Chen LG , Xie M , Liu HL , Ye WQ (2009) Identification of AFLP fragments linked to seedlessness in Ponkan mandarin (Citrus reticulate Blanco) and conversion to SCAR markers , Sci. Horticul, Vol.121 ; pp.505-510
    52. Xu DH , Wahyuni S , Sato Y , Yamaguchi M , Tsunematsu H , Ban T (2006) Genetic diversity and relationships of Japanese peach (Prunus persica L.) cultivars revealed by AFLP and pedigree tracing , Gen. Res. Crop Evol, Vol.53 ; pp.883-889
    53. Yeon IJ , Song MY , Hwang HJ , Sohn MH , Kim JB , Im YJ , Kim YS , Kim KS , Bang IC (2008) Population structure of the blue and purple types of the blue crab Portunus trituberculatus (Miers) from the west sea of Korea based on morphometric characteristics and AFLP analysis , J. Kor. Fish. Soc, Vol.41 ; pp.94-101
    54. Youn YN , Seo MJ , Shin JG , Jang C , Yu YM (2003) Toxicity of greenhouse pesticides to multicolored Asian lady beetles, Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae) , Biol. Con, Vol.28 ; pp.164-170
    55. Zhong D , Pai A , Yan G (2004) AFLP-based genetic linkage map for the red flour beetle (Tribolium castaneum) , J. Heredity, Vol.95 ; pp.53-61

    Vol. 40 No. 4 (2022.12)

    Journal Abbreviation Korean J. Appl. Entomol.
    Frequency Quarterly
    Doi Prefix 10.5656/KSAE
    Year of Launching 1962
    Publisher Korean Society of Applied Entomology
    Indexed/Tracked/Covered By