아이코사노이드(eicosanoid)는 다가불포화지방산의 산화물 이다. 특별히 탄소수 20 개의 아라키도닉산(arachidonic acid) 을 전구물질로 cyclooxygenase (COX) 또는 lipoxygenase (LOX) 의 산화작용에 의해 prostaglandin (PG)과 leukotrien (LT)의 아 이코사노이드류를 생합성하게 된다. 척추동물은 물론이고 곤 충에 있어서 이들 아이코사노이드류는 곤충의 면역, 배설 및 생 식 생리 작용을 중개한다(Stanley and Kim, 2014). 박각시나방 류인 Manduca sexta의 경우 아이코사노이드 생합성 억제는 세 포성 면역을 억제시켰다(Stanley-Samuelson et al., 1991). 노랑 초파리(Drosophila melanogaster)의 아이코사노이드 생합성 과정을 억제하면 그람 음성균에 대해서 반응하는 IMD 체액성 면역 신호전달과정을 교란했다(Yajima et al., 2003). 파밤나방 (Spodoptera exigua)의 경우 아이코사노이드 생합성 반응을 억 제시킨 상태에서 다양한 PG와 LT를 투여한 결과 세포성 및 체 액성 면역반응이 야기되었다(Shrestha and Kim, 2009). 이러한 면역 반응 이외에 아이코사노이드류는 말피기관의 물질분비 과정을 중개하여 이집트숲모기(Aedes aegypti)와 불개미류 (Formica polyctena)에서 배설을 촉진시켰다(Petzel and Stanley- Samuelson, 1992; Van Kerkhove et al., 1995). 또한 아이코사 노이드류는 곤충의 체온 조절에도 관여하여 사막 매미류(Tibicen dealbatus)의 기화열 발생을 중개하였다(Toolson et al., 1994). 아울러 아이코사노이드는 생식과정을 중개하여 귀뚜라미류의 산란행동을 촉진시켰다(Stanley-Samuelson and Loher, 1983; Stanley-Samuelson et al., 1986). 따라서 다양한 곤충 생리반응 을 중개하는 아이코사노이드에 대한 교란은 새로운 해충방제 제 개발의 방향을 제공할 수 있다(Kim, 2014).

곤충에서 아이코사노이드 생합성 과정을 밝히는 데 다양한 연구가 진행되어 왔다. 이러한 연구는 크게 두 가지 방향으로 주력되었다. 하나는 곤충 체내에 존재하는 아이코사노이드류 의 화학구조를 밝히려는 연구 방향이고, 다른 하나는 이들 물질 의 생합성 과정에 관여하는 효소들과 이들 유전자 구조를 밝히 는 것이다. 멸강나방류(Pseudaletia unipuncta)를 대상으로 혈 림프 시료에서 PGF_2α가 검출되었다(Jurenka et al., 1999). 비감 염 유충의 경우 0.9 ± 0.3 pg/mL의 수준에서 세균에 감염되면 4.0 ± 0.9 pg/mL으로 혈림프 내에 PGF_2α 농도가 증가하였다. 또 다른 PG류로서 귀뚜라미류(Acheta domesticus) 체내에서 PGE₂ 가 동정되었다(Destephano et al., 1974). 이들 아이코사노이드 를 생합성하는 체내 기구로서 분비성 phospholipase A₂ (PLA₂) 가 거짓쌀도둑거저리(Tribolium castaneum)에서 최초로 동정 되었다(Shrestha et al., 2010). 더불어 최근 파밤나방의 혈구세 포에서 특이적으로 발현되는 세포성 PLA₂가 동정되었다. 이후 유리된 아라키도닉산을 산화시키기 위해 COX 유전자가 파밤나 방에서 동정되었다(Park et al., 2014). 이러한 일련의 연구 과정 속에 아직도 풀리지 않은 의문점은 아이코사노이드 생합성 전구 물질이다. 이러한 이유는 아이코사노이드 생합성에 가장 잘 알려진 전구물질인 아라키도닉산이 곤충에서는 부재하거나 매우 낮은 농 도로 존재하기 때문이다(Howard and Stanley-Samuelson, 1996).

본 연구는 아이코사노이드 기능과 생합성 과정 모두에서 생 리적 기능이 밝혀진 파밤나방을 모델로 다양한 조직에 존재하 는 지질류에서 지방산을 분석하여 아이코사노이드 생합성 전 구물질을 추적하였다. 또한 기존에 파밤나방에서 동정된 세포 성 PLA₂가 조직의 지방산 조성 변화에 영향을 줄 수 있는 지도 함께 분석되었다.

재료 및 방법

파밤나방 사육 및 조직 분리

파밤나방은 Shrestha et al. (2010)의 방법으로 사육하였다. 본 연구에 사용한 공시충은 몸의 크기가 비교적 가장 큰 5령 2-3 일(25℃) 경과 유충을 이용하였다. 혈구세포는 혈림프 시료에 서 얻었다. 유충의 복부 다리를 자른 후 흘러나오는 혈림프를 phenylthiourea가 소량 들어있는 튜브에 받았다. 이를 5,000 rpm에서 5 분간 원심분리 후 침전된 혈구세포를 수거하였다. 동일한 유충에서 소화관, 지방체 및 체벽 조직을 인산완충용액 (PBS: 100 mM phosphate buffered saline, pH 7.4)에서 해부하 여 각각 수거하였다. 지방산 분석을 위해 각 반복 당 약 150 마 리의 유충이 조직 추출에 이용되었다.

조직 유래 지질 분리

파밤나방 5령 유충의 조직 시료량 대비 20 배의 n-hexane과 tert-butyl methyl ether (MTBE) 혼합액(1:1, v/v)을 가하여 20 분 간 초음파 처리(Branson, USA)하면서 2 회 추출하였다. Whatman No. 2 여과지로 여과한 후 잔사에 대해 Folch et al. (1957)의 방 법에 준하여 동량의 클로로포름 : 메탄올 (2:1, v/v)로 2 회 추출 하였다. 중성지질, 당지질 및 인지질의 분리를 위해 클로로포름 : 메탄올 추출물에 대한 실리카겔 컬럼(5.5 × 40 mm) 크로마토 그래피를 실시하였으며, 활성화시킨 실리카겔(70~230 mesh, Merck)을 충진한 후 용매 극성에 따라 클로로포름, 아세톤, 메 탄올을 순차적으로 용출하여 각각 중성지질, 당지질 및 인지질 을 차례로 분획하였다. 추출 여액 및 각각의 분획물은 40℃ 이 하에서 감압농축하였고 질소로 건고시킨 후 지방산 분석까지 –20℃에 보관하였다.

유리 지방산 분석

헥산 추출 및 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 획득된 지 질을 MIDI 방법(http://www.youngin.com/application/MIDI-2.pdf) 을 통해 유리지방산을 추출 및 메틸화를 실시하였다. 간략하 게, 지질 가수분해 반응용액(45 g sodium hydroxide, 150 mL methanol, 150 mL H₂O)을 각 지질 시료에 1 mL 첨가하고 100℃ 에서 30 분간 알칼리분해가 이뤄졌다. 이후 유리된 지방산을 메 틸화하기 위해 메틸화용액(325 mL 6 N HCl, 275 mL methanol) 을 각 시료에 2 mL 첨가하였다. 이후 80℃에서 10 분간 반응시 켰다. 메틸화된 지방산을 분리하기 위해 비극성용매(50 mL 헥 산, 50 mL MTBE)를 각 시료에 1.25 mL 첨가했다. 실온에서 10분간 반응시킨 후 상층액을 얻었다. 이 상층액을 중화시킨 후 GC/MS 분석에 이용하였다. GC/MS 분석을 위한 컬럼은 SP- 2560 (100 m × 0.25 mm i.d., 0.2 ㎛ film thickness, Supelco Inc., Bellefonte, Pennsylvania, USA)을 장착하였으며, 컬럼 오븐 온 도는 100℃에서 4 분 동안 유지한 후 240℃까지 분당 3℃씩 증 가하여 15 분 동안 유지하였다. 이동상 가스는 헬륨으로 0.8 mL/min, injector 225℃, ion source 200℃, separator 240℃로 설정하였다. 각각의 시료는 1 μL를 주입하여 분석하였고, split ratio는 20:1의 비율이었다. 분리된 피크는 Supelco사 표준지방 산 methyl ester의 머무름 시간과 비교하여 확인하였으며, 피크 면적비로서 지방산 조성 백분율을 구하였다. 또한 GC에 의해 분리된 피크의 mass spectrum을 GC/MS data system인 MS Chemstation (Hewlett Packard)에 설치된 NIST 및 Wiley library 와의 검색· 비교를 통해 지방산을 동정하였다. 지방산 분석은 독립적으로 3 회 이상 조직을 추출하여 분석하였다.

인지질분해효소의 RNA 간섭

파밤나방 유래 PLA₂ 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭 은 Park et al. (2015)의 방법을 따라 double stranded RNA (dsRNA)를 제조하였다. 대조구로서 폴리드나바이러스 유전 자 OF302 (Park and Kim, 2010)에 특이적 dsRNA를 dsCON으 로 이용하였다. 이렇게 준비된 dsRNA를 세포내 전달 물질인 Metafectene PRO (Biontex, Plannegg, Germany)와 1:1 (v/v) 으로 혼합하고 25℃에서 30 분간 반응시켜 dsRNA를 포함하는 리포좀을 형성시켰다. 이 리포좀을 5령 1일째되는 파밤나방 유 충 혈강에 26 gauge needle이 부착된 미세주사위(Hamilton, Reno, Nevada, USA)로 마리 당 1 ㎍의 dsRNA를 주입시켰다. dsRNA 처리 후 48 시간이 경과한 후 조직을 추출하여 상기의 방법으로 지방산 조성을 분석하였다.

통계분석

모든 살충효과 시험 결과는 백분율 자료로서 arsine 변환 후 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1989)을 이용하여 ANOVA 분석을 실시하였다. 얻어진 ANOVA를 기초로 평균간 비교는 DUNCAN의 다중검정 방법을 이용하였다. 유의성은 Type I error = 0.05의 기준에서 차이를 구분하였다.

결 과

조직별 다양한 지방산 분포

파밤나방 5령 유충을 대상으로 네 가지 서로 다른 조직에서 지질을 추출하였다. 추출된 지질은 중성지질, 당지질 및 인지질 로 분리하였다. 이 세 종류의 지질을 대상으로 포함된 지방산 조성을 분석하였다. 네 조직이 가지고 있는 지방산의 종류는 다 양하였다. 표피조직의 지방산을 분석한 결과(Table 1) palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid 및 linolenic acid가 검 출되었다. 이 가운데 포화지방산은 palmitic acid, 불포화지방 산은 linoleic acid가 가장 많이 포함되어 있었다. 지질별로 살펴 보면, 중성지질은 비교적 단순한 지방산 조성을 가지고 있었다. 반면에 당지질과 인지질은 보다 다양한 지질을 포함하고 있었 으며, 특별히 oleic acid와 linolenic acid에서 이들 지질별로 차 이가 나는 조성을 나타냈다. 불포화지방산 조성 가운데 인지질 의 경우 다른 지질에 비해 oleic acid를 적게 포함하고 있지만, linolenic acid는 가장 많이 포함하고 있는 지방산으로 나타냈다.

지방체 조직의 지방산 조성을 살펴보면(Table 2), 표피조직 과 유사한 조성을 나타내지만, 여기에 myristic acid와 palmitoleic acid가 추가로 검출되었다. 또한 미확인된 3 가지 지방산도 검 출되었다. 세 지질 모두 포화지방산은 palmitic acid가 대표적 이나, 불포화지방산의 경우 중성지질은 oleic acid를 그리고 다 른 지질은 linoleic acid를 우점 지방산으로 함유하고 있었다. 인 지질의 경우 포화지방산인 palmitic acid를 다른 지질에 비해 적게 갖는 반면, linolenic acid를 다른 지질에 비해 많게는 5 배 가량 많이 포함하고 있다. 더불어 당지질과 인지질은 미확인 지 방산 3 종류를 포함했다.

소화관의 지질별 지방산 조성이 분석되었다(Table 3). 이 조 직에서는 포화지방산으로 palmitic acid와 stearic acid가 검출 되었고, 불포화지방산으로 palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid 및 linolenic acid가 검출되었다. 이 조직에서도 지방체에 서 검출되었던 동일한 두 가지 미확인 지방산 종류가 검출되었 다. 지질별로 살펴보면, 포화지방산의 경우 중성지질과 당지질 은 palmitic acid가 우점하나, 인지질의 경우 stearic acid가 우점 하였다. 불포화지방산의 경우는 모두 linoleic acid를 우점 지방 산으로 함유하고 있었다. 인지질의 경우 포화지방산인 palmitic acid를 다른 지질에 비해 적게 갖는 반면, linolenic acid를 다른 지질에 비해 많게 포함하고 있다. 모든 미확인 지방산은 인지질 에서만 검출되었다.

혈구세포 조직에서 지질이 추출되고 각 지질별 지방산 조성 이 분석되었다(Table 4). 이 조직에서는 포화지방산으로 myristic acid, palmitic acid와 stearic acid가 검출되었고, 불포화지방산 으로 palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid 및 linolenic acid 가 검출되었다. 이 조직에서도 지방체에서 검출되었던 동일한 세 가지 미확인 지방산 종류가 검출되었다. 지질별로 살펴보면, 포화지방산의 경우 palmitic acid가 우점하고 불포화지방산의 경우는 모두 linoleic acid를 우점 지방산으로 함유하고 있었다. 인지질의 경우 포화지방산인 palmitic acid와 stearic acid를 다 른 지질에 비해 적게 갖는 반면, linolenic acid를 다른 지질에 비 해 많게 포함하고 있다.

조직별 그리고 지질 종류별 지방산 조성 차이에 대해서 유의 성을 검증하였다(Table 5). 모든 조직 및 지질 종류에서 지방산 의 조성은 큰 차이를 나타냈다(변수 ‘FA’에 해당한 변이원, Table 5A). 이들 지방산 조성의 차이는 조직별로 큰 차이를 나 타냈다(변수 ‘Tissue’에 해당한 변이원, Table 5A). 그러나 지 질 종류에 따라서는 전체적으로 큰 차이를 보이지 않았다(변수 ‘LIPID’에 해당한 변이원, Table 5A). 그러나 조직별로 분석하 여 보면 지질별로 큰 차이를 보인 조직이 표피세포라는 것을 알 수 있다(Table 5B).

아이코사노이드 생합성에 중요한 불포화지방산의 조성을 조직별 및 지질별로 산출하였다(Fig. 1). 전체적으로 불포화지 방산은 51-81%의 조성비를 나타냈다. 이러한 불포화지방산의 조성은 조직별로 상이하였고(F = 3.89; df = 3, 47; P = 0.0146), 또 지질별로도 상이하였다(F = 5.89; df = 2, 47; P = 0.0052). 또 한 지질별 불포화지방산의 조성 차이는 조직별로도 상이하였 다(F = 8.07; df = 6, 47; P < 0.0001). 따라서 지방체와 소화관에 서는 불포화지방산이 인지질에서 높지만, 표피조직에서는 인 지질에서 가장 낮은 불포화지방산 조성을 나타냈다.

지방산 조성에 미치는 iPLA2의 역할

칼슘비의존형 iPLA₂가 조직별 지방산 조성에 미치는 영향 을 분석하고자 이 유전자의 발현을 dsRNA로 억제시킨 후 지방 체와 소화관 조직별 지방산 조성 변화를 추적하였다(Table 6). iPLA₂ 유전자 발현에 대한 RNA 간섭효과는 Park et al. (2015) 에서 밝혀졌다. iPLA₂ 유전발현이 억제되는 조건에서 지방산 조성의 변화가 유발되었다. 지방체의 경우 이러한 변화는 중성 지질과 인지질에서 탐지되었다(Table 6A). iPLA₂ 유전자의 발 현 억제는 주요 포화지방산인 palmitic acid 조성 증가 및 주요 불포화지방산인 linoleic acid와 linolenic acid의 함량 감소를 일으켰다. 지방산 조성 변화가 소화관 중성지질에서 일어났지 만, 변화의 양상은 달랐다(Table 6B). 지방체와 마찬가지로 포 화지방산인 palmitic acid 조성 증가가 일어났지만, 불포화지방 산의 감소는 oleic acid에서 나타났다. 오히려 linoleic acid와 linolenic acid의 함량은 다소 증가하였다.

고 찰

파밤나방의 지방산 조성은 조직 및 지질 종류에 따라 상이하 였다. 그러나 대부분은 주요 포화지방산으로 palmitic acid와 stearic acid를 함유하고 있으며, 주요 불포화지방산으로 oleic acid, linoleic acid 및 linolenic acid를 지니고 있었다. 이는 일반 적인 동물류의 지방산 조성과 유사한 경향을 나타낸 것으로 판 단된다(Fast, 1971). 특별히 본 연구와 유사한 방법으로 실시된 딱정벌레류(Zophobas atratus)의 경우도 이들 지방산이 여러 발육태 및 서로 다른 지질류에서도 이러한 종류들의 지방산이 주로 검출되었다(Howard and Stanley-Samuelson, 1996). 또한 인지질에서 불포화지방산이 높게 나타나는 것도 유사한 경향 을 나타냈다. 그러나 특별히 차이가 나는 것은 α-linolenic acid (9,12,15-octadeccatrienoic acid)의 함량이다. Z. atratus의 경 우는 지방체에서 linoleic acid가 44.57%이고 linolenic acid가 0.35%인 반면에 파밤나방의 지방체 경우 linoleic acid가 32.6% 이고 linolenic acid가 무려 27.0%를 차지하였다. 이렇게 높은 파밤나방의 linolenic acid의 함량은 체벽(37.2%), 소화관(19.5%) 그리고 혈구(32.8%)에서도 나타나고 있다. 그러나 본 연구에 서 아이코사노이드의 생합성에 직접적 전구물질로 여겨진 아 라키도닉산을 검출하지 못하였다. 이는 곤충이 지방산 조성에 서 다른 동물과 차이점이 아라키도닉산 부재라는 특징(Bade, 1964)을 재확인시켜 주었다. 그럼에도 불구하고 여러 연구들 에서 곤충 조직에서 직접적으로 아이코사노이드 생합성이 가 능하다는 것을 시사하고 있다. 예를 들어, 박각시나방류인 M. sexta 혈구세포의 microsome 추출물은 아라키도닉산 기질을 변형하여 PGA₂, PGE₂, PGD₂와 PGF_2α를 생산할 수 있었다 (Stanley-Samuelson and Ogg, 1994). 또한 진드기류(Amblyomma americanum)에서는 프로스타글란딘 생합성 효소인 PGH ynthase 의 존재를 보여주었으며, 기내 합성 실험에 이용된 아라키도닉 산 기질로부터 PGA₂/PGB₂, PGD₂, PGE₂ 및 PGF_2α를 생성하였다 (Pedibhotla et al., 1995). 다시 M. sexta의 지방체는 위와 유사 한 실험 진행에서 PG는 물론이고 5-hydroxyeicosatetraenoic acid의 LT류 아이코사노이드를 생합성하였다(Gadelhak et al., 1995). 이와 더불어 서론에서 언급하였듯이 파밤나방에서 동 정된 다양한 PG 생합성 효소 유전자들(PLA₂, COX)의 존재는 곤충류가 아라키도닉산을 생합성하여 이를 PG 또는 LT로 생 합성하고 이를 통해 다양한 생리작용을 중개할 것으로 보인다.

아라키도닉산이 없으면서 아이코사노이드를 생합성할 수 있는 곤충은 포유류에서 밝혀진 전형적 아이코사노이드 생합 성과는 차이를 나타낼 수 있다. 첫째로 수서 곤충인 모기 유충 은 아라키도닉산을 생합성하여 인지질에 축적하였다. Dadd and Kleijan (1979)은 집모기류(Culex pipiens)가 성충으로 발 육하는 데 아라키도닉산을 요구하였다고 발표하였다. 모기의 먹이 가운데 아라키도닉산이 존재하기 어렵기 때문에 이는 자 체에서 생합성이 이뤄져야한다는 것을 내포하였다. 또한 모기 의 먹이에 아라키도닉산을 첨가하여 사육한 결과 주입된 아라 키도닉산은 모기 조직의 인지질에 축적되었다(Stanley-Samuelson and Dadd, 1981). 이에 더불어 linoleic acid에서 아라키도닉산 을 합성할 수 있는 간접적 증거가 나왔다. 우선은 동물체에서 합성하지 못하는 linoleic acid가 여러 곤충류에서 가능하였다 (Blomquist et al., 1991). 이를 뒷받침하는 유전적 증거로서 Δ 12 desaturase가 이들 곤충류에서 동정되었다(Cripps et al., 1990). 따라서 linoleic acid에서 사슬연장 및 불포화반응을 통해 C20 의 다가불포화지방산의 생합성이 가능해질 수 있다. 예를 들어, 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)의 경우 α-linolenic acid 를 유충 먹이 첨가할 경우 성충 조직에서 추출된 인지질 성분 에 C20의 다가불포화지방산이 검출되었다(Stanley-Samuelson and Dadd, 1984). 이러한 아라키도닉산 생합성은 미국바퀴벌 레(Periplaneta americana)와 귀뚜라미류(Acheta domesticus) 에서도 밝혀졌다(Jurenka et al., 1987, 1988). 향후 곤충에서 리 놀레익산에서 아라키도닉산을 합성하는 관련 효소 및 유전자 의 동정이 기대된다.

조직별 및 지질 종류에 따라 상이한 지방산 조성은 이를 조 절하는 인자의 존재를 제시하고 있다. 본 연구에서는 이러한 인 자들 가운데 하나로서 칼슘에 비의존적 세포성 PLA₂를 주목하 였다. 인지질 분해효소인 PLA₂는 척추동물의 경우 다양한 유 전자군을 이루지만, 크게 세 종류로 나뉜다(Burke and Dennis, 2009). 우선 위치에 따라 세포성 PLA₂와 분비성 sPLA₂로 나뉘 고, 세포성 PLA₂는 다시 칼슘의존도에 따라 칼슘의존형 cPLA₂ 와 비의존형 iPLA₂로 구분된다. 특히 iPLA₂는 여러 기능에 관 여하지만 척추동물의 경우 주로 생체막에 지방산 조성을 유지 하는 데 역할을 담당하는 것으로 알려지고 있다(Balsinde et al., 1997; Barbour et al., 1999). 본 연구는 RNA 간섭으로 이 유전 자의 발현을 억제한 경우 대조구에 비해 중성지질과 인지질에 서 불포화지방산의 함량이 크게 낮아지고 포화지방산의 함량 이 높아졌다. 이 iPLA₂가 파밤나방의 면역에 관여하는 것으로 판명되었기에(Park et al., 2015) 이러한 인지질 조성 변화와 더 불어 iPLA₂는 여러 다른 생리적 반응에 관여할 것으로 여겨진다.

본 연구 궁극적 목표는 파밤나방 유충의 여러 조직에서 아이 코사노이드의 전구체 다가불포화지방산을 찾는 데 주력하였 다. 아라키도닉산을 검출하지는 못하였지만 다량의 다가불포 화지방산들(linoleic acid와 linolenic acid)이 인지질에 보다 많 이 분포하는 지방산 조성에 특징을 발견하였다. 따라서 외부 미 생물의 침입에 대해서 면역신호는 이들 인지질에 연결된 불포 화지방산을 아라키도닉산으로 전환하여 아이코사노이드 중개 물질을 생합성하는 데 이용될 수 있을 것으로 추정하며, 이에 대한 후속 연구가 필요하다.