국내 저장 곡물 및 식품을 가해하는 다양한 해충 주로 딱정 벌레목 및 나비목 해충이 가장 많이 차지하며, 여기에 응애류도 포함되고 있다(Choi et al., 1996). 특별히 곡물의 수확기의 기 온이 높아 저장 초기에 이러한 해충의 발생과 생육이 가능하여 이에 따른 피해를 증가시키게 된다. 이러한 저장물 해충에 따른 피해는 약 5-10%로 추산되며, 미국의 경우 밀과 옥수수의 경우 연간 125-250 억불의 경제적 피해를 주고 있다(USDA, 2005).

수확후 해충 관리기술은 크게 화학적 및 물리적 처리법으로 대별된다(Paull and Armstrong, 1994; Sharp and Hallman, 1994). 화학적 처리법은 메틸브로마이드나 포스핀과 같은 훈증 처리 와 표면에 정착하는 해충을 제거하는 비누화물질 또는 화학농 약 처리를 포함한다. 반면에 물리적 처리법은 온도(고온, 저온) 처리, 환경조절처리, 방사선처리 및 이들의 혼합처리를 포함한 다. 온도 처리는 해충의 온도에 대한 생존 한계 범위를 이용한 방제 기술이고, 환경조절처리는 높은 농도의 이산화탄소와 낮 은 농도의 산소를 결부한 온도 처리를 의미한다(Carpenter and Potter, 1994; Neven and Drake, 2000; Na et al., 2006). 방사선 조사는 해충의 DNA의 화학결합을 붕괴시킴으로 소독효과를 발휘하게 한다. 기타 물리적 처리법으로 오존처리(Hollingsworth and Armstrong, 2005; Kells et al., 2001), 마이크로파처리 (Ikediala et al., 1999), 라디오주파열처리(Nelson, 1996; Tang et al., 2000; Wang et al., 2002), 고압산소처리(Butz and Tauscher, 1995) 및 진공처리(Liu, 2003)를 포함하게 된다. 그러나 이 가 운데 가장 많이 사용되는 저장물 해충 방제 처리는 메틸브로마 이드 훈증 처리이지만, 이는 오존층 파괴물질로 점차 사용이 금 지될 전망이며 대체 기술 개발이 시급하게 요구되고 있다.

이산화염소는 높은 살균작용으로 실용화되고 있는 소독제 이다. 최근 이 화합물을 전기분해방식을 통해 훈증제로 개발하 여 저장 곡물을 가해하는 해충에 대해서 새로운 방제제로 유용 성을 모색하고 있다. 이 가운데 이 훈증제가 화랑곡나방을 대상 으로 살충작용을 보이는 연구 결과가 나왔다(Kumar et al., 2015). 이산화염소의 살충기작은 이 화합물이 곤충 체내에서 활성산 소를 증가시키는 기작으로 해석되고 있다. 그러나 딱정벌레를 대상으로 하는 경우 이산화염소 처리에 대한 회피행동이 관찰 되었고, 이에 따라 이산화염소 훈증 처리의 효과를 크게 둔화시 켰다.

본 연구는 이산화염소에 대한 곤충의 회피행동을 억제하기 위해 열처리 혼합 기술을 고안했다. 이를 수행하기 위해 우선 곤충의 이산화염소에 대한 회피행동을 정량화하였다. 이후 열 처리 또는 이산화염소의 단독 처리효과와 혼합처리효과를 각 각 비교분석하여 새로운 방제기술을 개발하였다.

재료 및 방법

거짓쌀도둑거저리 증식

공시충인 거짓쌀도둑거저리 먹이는 밀가루(100 g), 밀배아 (50 g) 및 이스트추출물(15 g)을 혼합하여 제조하였다. 사육용 기는 지름 15 cm의 원형 플라스틱통에 약 5 cm 정도 먹이를 채 우고, 모든 발육시기를 혼합하여 사육하였다. 공기순환을 위해 사육통의 윗면은 망사로 덮었다. 약 3-4주 간격으로 먹이를 교 환하여 주었다. 시험에 이용된 유충은 길이 5 mm 이상의 크기 였다. 성충은 우화 후 10 일 이내의 개체를 선발하여 시험에 이 용하였다. 모든 곤충은 25°C 온도조건, 60% 상대습도 조건에 서 사육되었다.

Y 튜브 행동 분석

유리 재질의 Y 튜브는 3 cm 내부 직경으로, 양쪽 팔의 길이 는 16 cm이고 서로 45 °의 각도로 벌려져 있으며, 공통관의 길이 는 13 cm로 구성되었다(Fig. 3A 참조). 질소 가스가 양쪽 팔로 연결되어 공통관을 통해 빠져나가도록 설계했다. 질소 가스는 우선 수증기를 포함하기 위해 물이 반쯤 차있는 병을 통해 Y 튜 브의 양쪽 팔로 들어가게 했다. 주입 질소 가스의 속도는 300 mL/min으로 설정했다. 양쪽 팔 말단에 거짓쌀도둑거저리 먹이 를 500 mg 투입하고 여기에 대조구는 인산완충용액, 처리구는 이산화염소 용액(800 ppm)을 각각 100 μL씩 처리하였다. 처리 될 거짓쌀도둑거저리 성충은 24 시간 절식시킨 후 공통관 기부 에 놓고 10 분간 움직이는 방향으로 결과를 얻었다. 이때 출발 점으로 부터 먹이 쪽으로 3 cm 움직인 개체를 반응한 개체로 규 정하였으며, 분지점을 지나 어느 한쪽으로 움직인 개체는 분지 점으로부터 12 cm 움직인 개체를 특정 처리를 선호한 개체로 판명하였다. 처리 후 Y 튜브는 95.5% 아세톤으로 세척하고, 이 를 다시 99% 헥산으로 재세척을 실시하였다. 끝으로 물로 헹군 후 건조시켜 다음 실험에 이용하였다.

보행행동 분석

거짓쌀도둑거저리 성충의 이산화염소 노출 후 보행거리 및 보행속도를 곤충행동측정기(EthoVision XT, Version 9.0, Noldus Information Technology, Wageningen, Netherland)로 분석하 였다. 행동분석용 경기장은 직경 55 mm의 페트리디쉬를 이용 하였으며, 중앙부위에 1.5 mL E-tube 뚜껑을 놓고 여기에 이산 화염소(800 ppm) 액체 또는 인산완충용액 200 μL를 올려놓았 다. 전체 행동은 5 분간 관찰되었고, 각 처리에는 30 마리의 개 체로 반복하였다. 처리 기간 동안 온도는 25°C, 상대습도는 40% 이었다.

이산화염소 훈증 처리

이산화염소는 전기분해 방식으로 제조하였다. 물에 녹여놓 았다가 가스 형태로 훈증시키는 것이기 때문에 농도조절이 가 능하였고 이를 아크릴판으로 특수 제작한 밀폐된 챔버에 가스 발생장치(푸르고팜, 화성, 대한민국)를 이용하여 투여했다. 시 험 곤충은 50 mL 튜브에 소량(약 10개) 현미와 함께 투여되었 다. 이 용기의 윗면은 망사로 씌어 훈증제 처리가 가능하게 하 였다. 이 곤충 용기를 이산화염소 처리 챔버에 넣고 처리 기간 동안 가스누출검지기(Gas leak detector C16, Analytical technology, Collegeville, PA, USA)로 이산화염소 농도를 지속적 으로 모니터링해서 처리 농도를 확인했다.

이산화염소에 대한 거짓쌀도둑거저리의 감수성 분석

이산화염소 농도 처리는 0, 100, 200, 400 및 800 ppm을 이 용하였다. 각 농도 처리는 3 반복으로 24 시간 노출시켰다. 처 리 후 25°C 실내 조건에서 72 시간 방치 후 사망률을 조사하였 다. 유충과 성충의 사망 판정은 핀셋으로 복부를 가볍게 눌렀을 때 자의적 행동이 없는 상태로 규정하였다. 번데기의 사망 판정 은 흉부를 핀셋으로 잡았을 때 복부의 움직임이 없는 상태로 규 정하였다.

열처리와 복합처리

열처리는 항온수조를 이용하여 46°C의 열처리가 실시되었 다. 공시충은 10 mL 먹이가 채워진 50 mL 튜브에 15 마리씩 처 리되었다. 항온수조의 물이 튜브의 뚜껑 부위까지 차도록 처리 하였다. 뚜껑 부위는 망사로 대체하였다. 이 항온수조를 이산화 염소 훈증제 처리 챔버 내부로 옮겨 무처리와 400 ppm 이산화 염소 처리를 각각 6 시간 및 12 시간 동안 실시하였다. 동일 조 건에서 이산화염소 단독 처리는 항온수조 밖의 이산화염소 처 리 챔버 내부에서 동시에 실시되었다. 각 처리는 3 반복으로 실 시되었다.

통계분석

모든 살충효과 실험결과는 백분율 자료로서 arsine 변환 후 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1989)을 이용하여 ANOVA 분석 및 처리 평균 간 비교를 실시하였다.

결 과

거짓쌀도둑거저리에 대한 이산화염소의 독성

이산화염소 훈증제 처리에 대한 거짓쌀도둑거저리의 감수 성을 분석하였다(Fig. 1A). 거짓쌀도둑거저리에 대한 이산화 염소는 처리 농도(F = 196.10; dF = 4,22; P < 0.0001)에 따라 뚜 렷한 독성을 주었다. 이러한 이산화염소의 농도별 독성 증가는 유충과 성충 모두에 대해서(F = 0.06; dF = 4, 22; P = 0.3083) 유 사하게 나타났다. 그러나 발육시기에 따라 이산화염소에 대한 감수성이 상이하여(Fig. 1B), 유충과 성충에 비해 번데기가 높 은 감수성(F = 0.54; dF = 2, 22; P < 0.0001)을 나타냈다. 거짓쌀 도둑거저리에 대한 이산화염소의 반수치사농도(LC₅₀)는 유충 에 대해 383.67 ppm (153.63 - 955.78 ppm: 95% 신뢰구간), 성 충에 대해 397.75 ppm (354.46 - 446.13 ppm: 95% 신뢰구간) 을 보였다.

회피행동에 따른 이산화염소 독성 저하

밀가루 먹이를 다양한 부피로 처리 튜브에 채워주었을 때 이 산화염소에 대한 거짓쌀도둑거저리의 감수성은 유충과 성충 모두의 회피행동에 따라 크게 감소하였다(Fig. 2). 이러한 감수 성 저하는 공급된 먹이량(F = 49.0; dF = 7, 32; P < 0.0001)에 비 례하여 뚜렷이 나타났다. 이러한 경향은 유충과 성충 모두에서 유사하게(F = 0.82; dF = 7, 32; P = 0.5773) 나타났다. 특별히 먹 이량이 5 mL 이상의 경우(약 2 cm 이상 깊이)에서는 거의 처리 효과를 나타내지 못하였다.

거짓쌀도둑거저리가 이산화염소를 회피하는 지를 분석하기 위해 Y 튜브 생물검정을 실시하였다(Fig. 3). Y 튜브 양쪽 말단 에 곤충의 먹이를 각각 두었다(Fig. 3A). 처리구는 800 ppm 이 산화염소를 처리하였고, 대조구는 동일한 부피의 인산완충용 액을 처리하였다. 이때 거짓쌀도둑거저리 가운데 먹이 쪽으로 움직이는 행동 반응을 보인 개체가 약 82%를 차지하였다(Fig. 3B). 그러나 촉각을 제거한 경우 무반응을 보이는 개체가 전체 의 약 77%를 차지하였다. 먹이 쪽으로 반응을 보인 정상적 개 체 가운데는 이산화염소가 처리되지 않은 쪽으로 약 88%가 움 직였다(Fig. 3C). 그러나 촉각이 제거된 거짓쌀도둑거저리는 대부분 먹이에 대한 감지 능력을 잃었고, 일부 반응을 보인 개 체들은 오히려 이산화염소 처리된 곳으로 치우쳐져서 대조구 대비 이산화염소에 대한 감지능력(X² = 35.6; dF = 2; P < 0.0001) 을 잃었다. 이러한 회피행동은 이산화염소 처리에 따라 증가된 보행행동 속도와 거리 증가에서도 뒷받침하고 있다(Fig. 4).

열처리와 혼합에 따른 이산화염소 독성 회복

이산화염소에 대한 거짓쌀도둑거저리의 감수성 저하는 먹 이 속으로 파고 들어가면서 이산화염소 노출을 회피하는 행동 에서 기인한 것으로 관찰되었다. 이러한 회피행동을 줄이기 위 해 열처리를 병행하였다(Fig. 5). 열처리 단독으로는 6 시간 처 리에서 약 4.4% 살충력을 보였고, 12 시간을 처리한 결과 93.3% 살충력을 보였다. 그러나 400 ppm의 이산화염소를 처리한 결 과 두 시간 처리 모두에서 전혀 살충력을 나타내지 못했다. 그 러나 두 처리를 병행한 경우 6 시간 처리에서 약 95%의 살충력 을 나타내 두 처리의 뚜렷한 시너지효과(F = 160.82; dF = 2, 12; P < 0.0001)를 나타냈다. 그리고 12 시간을 처리한 두 처리 병 행은 완전 방제효과를 나타냈다.

고 찰

이산화염소는 병원성 세균 및 바이러스에 대해 넓은 항생능 력을 보이고 있다. 즉, 이산화염소는 식품 오염 병원세균류(Bang et al., 2014; Sun et al., 2014), 구강 오염세균류(Taneja et al., 2014; Aung et al., 2015), 음용수 오염세균류(Vlad et al., 2014) 및 일반 식기 오염세균류(Nam et al., 2014)에 대해서 우수한 항 생능력을 보였다. 특별히 여러 항생제에 대해서 내성을 보이는 세균류에 대해서 이산화염소는 기존의 차아염소산나트륨(NaClO) 에 비해 탁월한 항생능력을 나타냈다(Hinenoya et al., 2015). 또한 이산화염소는 수족구병을 유발하는 엔테로바이러스 71 (EV71)을 비롯한 다양한 인체 병원바이러스에 대해서 항바이 러스 활성을 나타냈다(Sanekata et al., 2010; Jin et al., 2013).

최근 기체 상태로 훈증 처리가 가능한 이산화염소는 위생해 충 및 저곡해충에 대한 살충력을 나타낼 수 있다. 병원 시설에 발생하는 빈대류(Cimex lectularius, Cimex hemipterus)에 대 해서 비교적 높은 농도(약 1,000 ppm)의 이산화염소 노출에 대 해서 속효성의 방제 효과를 나타냈으며(Gibbs et al., 2012), 저 곡류를 가해하는 화랑곡나방(Plodia interpunctella)에 대해서 도 비교적 낮은 농도(200 ppm)의 노출에서 완전방제 효과를 나 타냈다(Kumar et al., 2015).

본 연구는 이산화염소 훈증 처리를 거짓쌀도둑거저리에 적 용한 결과 직접 노출 조건에서 살충효과를 갖는 것을 보여주었 다. 이산화염소 훈증 처리를 12 시간 지속시킨 결과 약 383-397 ppm의 처리 농도에서 유충과 성충에 대해서 반수치사농도를 보였다. 그러나 이산화염소에 대한 감수성은 발육시기별로 차 이가 있어 동일한 조건의 이산화염소 처리에서 번데기에 비해 유충과 성충이 약제 내성이 높은 것으로 나타났다. 이산화염소 의 살충효과는 이 물질이 갖는 높은 산화력에 기인한 것으로 보 인다. Kumar et al. (2015)은 이산화염소를 화랑곡나방에 처리 한 결과 혈구세포에 대한 세포독성을 보인 것을 밝혔다. 이러한 세포독성은 이산화염소 처리에 따라 높은 농도로 발생되는 활 성산소에 기인한 것으로 판명되었다. 따라서 발육시기별로 이 산화염소에 대한 감수성의 차이를 보인 것도 이들의 활성산소 발생 능력에 차이가 있는 것으로 사료된다. 이를 증명하기 위해 서 발육시기별 활성산소의 발생량 변화를 추적할 필요가 있다.

이산화염소의 살충력은 거짓쌀도둑거저리의 회피행동에 의 해 둔화되었다. 먹이인 밀가루를 제공한 결과 이산화염소 노출 에 따라 먹이 속으로 파고들어가는 회피행동을 보였다. 먹이를 1 cm 깊이로 제공한 경우 살충력은 급격하게 떨어졌고, 2.5 cm 이상으로 제공한 결과 거의 살충효과를 나타내지 못하였다. 이 는 기체 상태의 이산화염소가 1 cm 깊이의 밀가루 먹이 속으로 유효한 침투력을 발휘하지 못한다는 것을 의미한다. 거짓쌀도 둑거저리의 회피행동은 Y 튜브 검정에서도 뚜렷한 회피를 보 이는 행동에서도 뒷받침되었다. 반면, 이산화염소 처리는 거짓 쌀도둑거저리의 보행속도를 증가시켰다. 이는 아마도 이산화 염소 노출에 따라 회피행동 반응을 자극하는 데에서 기인된다. 거짓쌀도둑거저리는 일반적으로 자신에게 해로운 물질에 대해 서 회피행동을 보일 수 있다. 예를 들어, 식물 정유에 포함된 테 르펜류는 거짓쌀도둑거저리에 대해서 살충효과를 주는데, 이 러한 물질을 감지하는 개체들은 기피행동을 보이고 있다(Khan et al., 2014; Wua et al., 2014). 이산화염소도 살충효과를 보이 고, 이에 대해 거짓쌀도둑거저리는 회피행동을 보인 것으로 해 석된다. 이러한 물질 감지는 거짓쌀도둑거저리의 촉각에서 기 인되었다는 것이 본 연구의 촉각 제거 실험에서 증명되었다. 추 후 이 촉각에 위치한 화학감각기의 동정이 요구된다.

열처리에 따라 이산화염소에 대한 거짓쌀도둑거저리의 회 피행동이 억제되었다. 거짓쌀도둑거저리에 대해서 46°C의 고 온 처리는 살충효과를 주었고, 이 가운데 유충보다는 성충이 열 에 대한 내성을 보여 주었다(Son et al., 2010). 본 연구에서 이 용한 46°C 고온에서 6 시간 처리한 결과 살충력은 10% 미만이 지만, 12 시간 처리하면 거의 90% 이상의 살충효과를 나타냈 다. 이러한 열처리에 대해서 거짓쌀도둑거저리 성충은 고온을 감지한 것으로 보인다. 이는 이 온도에 대해서 성충들이 먹이 밖으로 나온 행동에서 뒷받침된다. 비교적 밀가루 먹이 내부보 다는 먹이 밖에서 기문이나 구강을 통해 기화열 발산이 용이하 기에 이들 성충이 먹이 밖으로 나온 것으로 추정된다. 거짓쌀도 둑거저리의 온도 감지에 대해서 최근 TRPs (transient receptor potential channels) 감각기가 밝혀졌다. 노랑초파리에서 알려 진 TRPs 유전자들과 1:1 대응으로 후보유전자들이 밝혀졌고, 이 가운데 trpA1 유전자의 경우는 고온 감지에 관여하는 것으 로 기능 분석되었고, painless와 pyrexia 유전자들은 고온 적응 에 관여하는 유전자로 추정되고 있다(Kim et al., 2015). 본 연 구에서 보인 열에 대한 행동 변화는 trpA1 유전자 산물이 관여 하여 46°C의 고온을 감지하여 이뤄진 것으로 추정된다. 물론 여기에 painless와 pyrexia 유전자들은 고온 적응행동에 관여 하였을 것으로 추정된다. 반면 이산화염소 농도를 400 ppm으 로 올려서 거짓쌀도둑거저리에 처리한 결과, 6 시간과 12 시간 노출 모두에서 전혀 살충효과를 나타내지 못하였다. 이는 이들 성충이 모두 약제를 회피하여 먹이 속으로 숨는 행동에서 기인 되었다. 그러나 고온도 함께 이산화염소를 처리한 결과 방제효 과가 크게 증가하였다. 이는 이 곤충이 고온을 감지하는 능력과 더불어 적응하는 행동이 발현되어 이산화염소에 대한 회피행 동을 억제시킨 것으로 해석된다. 즉, 이산화염소 노출에 따른 먹이 속으로 회피행동이 열처리에 따라 고온 적응 행동으로 바 뀌어 오히려 먹이 밖으로 나오게 함으로 약제에 직접 노출되면 서 약효를 증가시킨 것으로 해석된다.

본 연구 결과는 고온 처리가 이산화염소에 대한 거짓쌀도둑 거저리의 회피행동을 억제하는 것으로 나타났고, 이러한 효과 가 이 약제의 살충력을 증가시킨다는 가설을 뒷받침하고 있다.

본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림수산식품기술 평가원의 농생명산업기술개발사업(114063-03)의 지원을 받 아 연구되었다.