담배가루이(Bemisia tabaci)는 노린재목(Hemiptera) 가루 이과(Aleyrodidae)에 속하며, 세계자연보전연맹에서 지정한 세계 100대 침입해충 중 하나이다(Boykin et al., 2007). 담배가 루이는 직접적인 흡즙 피해와 감로배설로 인해 그을음병을 유 발하여 시설재배 작물의 수량과 상품성에 큰 영향을 미치는 주 요한 해충으로 알려져 있다(Byrne, 1999; Bedford et al., 1994). 뿐만 아니라 담배가루이는 500종 이상의 넓은 기주범위를 가 지고 있으며, 100종 이상의 바이러스를 매개하는 것으로 알려 져 있어 각별한 주의가 필요하다(Secker et al., 1998; Jones, 2003).

최근 RNAi (RNA interference)는 농업해충 방제를 위한 대 안적 전략으로 여겨지고 있다(Huvenne and Smagghe, 2010; Price and Gatehouse, 2008; Baum et al., 2007). RNAi에 의한 gene silencing은 세포 내로 유입된 dsRNA (double-stranded RNA)가 RNaseⅢ 활성을 갖는 Dicer라는 효소에 의해 siRNA (21~25 nt)로 잘리고, 이 siRNA는 RISC (RNA induced silencing complex)와 결합 후 상동성의 mRNA에 결합 함으로써 mRNA 발현을 억제시키는 과정을 말하며, 식물에서는 PGTS (posttranscriptional gene silencing)와 비슷한 현상이다(Sijen et al., 2001; Liu et al., 2002; Hahn, 2010).

곤충 유전자는 dsRNA의 직접적인 injection이나 dsRNA를 인공먹이에 섞은 뒤 인공먹이를 곤충에게 섭식시키는 방법으 로 유전자 발현량의 감소를 확인할 수 있지만(Bettencourt et al., 2002; Whyard et al., 2009; Luo et al., 2013; Christiaens et al., 2014; Sapountzis et al., 2014; Walshe et al., 2009), 이러한 dsRNA의 전달 방법은 야외포장에서 RNAi 기술을 이용하여 해충을 방제하기에는 어려움이 있어 야외포장에서 RNAi 기술 을 사용하기 위해서는 dsRNA의 효과적인 전달방법의 모색이 필요하다.

식물바이러스가 기주세포에 감염되었을 때, 식물은 바이러 스 genome을 타겟으로 RNA를 기반으로 하는 방어를 활성화 시킨다. VIGS (virus-induced gene silencing)는 이러한 RNA 가 매개하는 항 바이러스성 방어기작을 이용하는 기술이다(Lu et al., 2003). VIGS 벡터를 사용하면, 벡터 안에 있는 target 유 전자의 mRNA 조각이 발현됨으로써 target mRNA의 knock out이 가능하다. 식물 RNA 바이러스가 복제되면서 만들어지는 dsRNA는 전사 후 유전자 침묵(post transcriptional gene silencing (PTGS))을 유도하게 된다(Baulcombe, 2004). 이러한 VIGS vector에 흡즙형 곤충의 유전자를 cloning하여 식물에 접종하 게 되면 virus 복제 과정에서 곤충유전자의 dsRNA가 생성이 되고, 이를 타겟 흡즙형 곤충이 식물을 흡즙할 때 dsRNA를 같 이 섭식하여 곤충체내에서 RNAi를 유도할 수 있다.

담배가루이에서도 많은 RNAi 연구가 진행되었다. Chickadee 유전자를 가지고 injection을 통해 실제로 chickadee유전자의 발현량이 감소하는 것을 확인하였으며(Ghanim et al., 2007), 인공먹이에 V-ATPase dsRNA를 섞어 섭식시킴으로써 유전자 발현량의 감소를 확인하였고(Upadhyay et al., 2011), heat shock protein dsRNA를 인공먹이에 섞어 섭식시킴으로써 RNAi를 통해 담배가루이에서 heat shock protein 유전자의 역할을 확인 하였다(Lü and Wan, 2011). 이러한 이전 연구들로 담배가루이 에서 dsRNA의 injection과 섭식을 통해 RNAi가 가능하다는 것이 입증되었으며, 담배가루이 방제를 위한 RNAi도 시도하 고 있다. 그러나 담배가루이의 유전자 구성이 아직 잘 알려져 있지 않으며. 오직 담배가루이의 발달 단계에서 몇몇의 EST서 열만이 보고되어져 있어(Leshkowitz et al., 2006), RNAi 방제 를 위한 target 유전자를 선발하는데 어려움이 있다.

본 연구에서는 VIGS 벡터를 사용하여 담배가루이 RNAi 방 제를 위한 target유전자를 선발하기 위해 방법을 조금씩 수정해 가며 VIGS vector에 적절한 담배가루이 cDNA library를 제작 을 시도하였다.

재료 및 방법

실험 곤충 사육 및 채집

담배가루이(Bemisia tabaci)의 사육은 곤충사육실에서 25±1℃, 16L:8D, 상대습도 50~60%의 조건으로 아크릴케이지(30×30× 50 cm)에서 토마토(서광)를 기주식물로 하여 계대사육하였다. 계대사육중인 담배가루이가 많이 증식하면 흡충기를 이용하여 담배가루이를 채집하여 total RNA를 뽑을 때까지 -80℃에 보 관하였다.

Total RNA 추출 및 mRNA 분리

Trizol reagent(MRC)를 사용하여 담배가루이 total RNA를 추출한 후, 이 total RNA로부터 FastTrack^Ⓡ MAG mRNA isolation Kit (Invitrogen)를 사용하여 mRNA를 분리하였다.

cDNA library 제작

cDNA library 제작은 Super Script^® Full length cDNA Library Construction Kit II protocol (Invitrogen)을 기본으로 방법을 조금씩 수정하여 실험을 실시하였다.

Oligo d(T) primer를 이용한 cDNA library 제작

정제한 mRNA를 Biotin-attB2-oligo d(T) primer를 사용하 여 first strand cDNA를 합성하였다(Table 1). 불순물을 제거하 기 위해 Ethanol down 후 RNaseⅠ을 처리하여 cDNA를 제외 한 주형 RNA를 제거해 주었다. 다시 Ethanol down 후 attB1- adapter-U와 attB1-adapter-L를 annealing시켜 주문 제작한 double-strand 5’attB1 adapter을 T4 DNA ligase를 사용하여 ligation 시켰다(Table 1). Kit를 사용하여 cDNA purification을 실시한 후, LA Taq ™ DNA polymerase (Takara)와 attB1-adapter- U primer를 사용하여 second strand를 합성하였다(Table 1). 이렇게 합성된 second strand cDNA는 cDNA Size fraction column을 이용하여 size fraction을 실시 하였다. cDNA의 크기에 따라 총 5개의 fraction으로 분리한 cDNA를 각각 1.5 ml tube에 넣어 ethanol down을 실시한 후, 이중 4번과 5번 fraction을 각각 pDONR ™ 222 vector (Invitrogen)의 att P1, P2 site를 attB1, B2 site를 갖는 담배가루이 cDNA 단편으로 교체하는 BP recombination을 실시하였다. Electro MAX ™ DH10B ™ T1 Phage Resistant Cells (Invitrogen)를 사용하여 1.8 kV, 200 Ω, 25 μF의 조건으로 electro-transformation을 실시하였다. Transformation된 sample 에 SOC 배지(2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM glucose) 를 1 ml 추가한 뒤 37℃에서 1시간 shaking incubate 후 cDNA library를 10^-4까지 연속희석 하여 kanamycin (1 μg/ml)을 포함 한 LB plate배지 100 μL씩 도말하여 37℃에서 overnight하였다. Overnight 후 colony를 카운팅하여 titer를 측정하였으며, fraction 별 랜덤하게 12개의 plasmid를 isolation 후 제한효소 BsrGⅠ (NEB)을 처리하여 cutting한 뒤 전기영동을 통해 담배가루이 cDNA library insert 크기를 확인 하였다.

N25 random primer와 6초 sonication방법을 이용한 cDNA library 제작

300~700 bp의 cDNA insert를 만들기 위해 정제한 mRNA를 Vcx 750 watt ultrasonic processor (SONICS & MATERIALS) 를 사용하여 sonication을 6초동안 실시하였다. 잘려진 mRNA 단편을 Biotin-attB2-N₍₂₅₎ primer를 사용하여 first strand cDNA 를 합성하였다(Table 1). First strand cDNA를 RNaseⅠ을 처리 하여 cDNA를 제외한 주형 RNA를 제거해 주었다. 다시 Ethanol down 후 double-strand 5’attB1 adapter을 T4 DNA ligase를 사 용하여 ligation 시켰다(Table 1). Kit를 사용하여 cDNA purification을 실시한 후, LA Taq ™ DNA polymerase (Takara)와 attB1 adapter-U primer를 사용하여 second strand를 합성하였다 (Table 1). 이렇게 합성된 second strand cDNA는 cDNA Size fraction column을 이용하여 size fraction을 실시하였다. 총 9개 의 1.5 ml tube에 나눠 받은 cDNA를 ethanol down 후 농도가 잘 나온 5번과 9번 fraction tube를 각각 pDONR™222 Vector (Invitrogen)와 BP recombination을 실시하였다. Electro MAX ™ DH10B ™ T1 Phage Resistant Cells (Invitrogen)를 사용하여 1.8 kV, 200 Ω, 25 μF의 조건으로 electro-transformation을 실 시하였다. Transformation된 sample에 S.O.C 배지를 1 ml 추가 한 뒤 37℃에서 1시간 shaking incubate 후 cDNA library를 10^-4 까지 연속 희석 하여 kanamycin (1 μg/ml)을 포함한 LB plate 배지 100 μL씩 도말하여 37℃에서 overnight 하였다. Overnight 후 colony를 카운팅하여 titer를 측정하였으며, fraction 별 랜덤 하게 12개의 plasmid를 isolation한 뒤 제한효소 BsrGⅠ(NEB) 을 처리하여 cutting 후 전기영동을 통해 담배가루이 cDNA library insert 크기를 확인하였다.

Oligo d(T) primer와 2초 sonication 방법을 이용한 cDNA library 제작

정제한 mRNA를 Biotin-attB2-oligo d(T) primer를 사용하 여 first strand cDNA를 합성한 뒤(Table 1), RNaseⅠ을 처리하 여 cDNA를 제외한 주형 RNA를 제거해 주었다. 400~500 bp의 cDNA insert를 만들기 위해 first strand cDNA를 Vcx 750 Watt ultrasonic processor (SONICS & MATERIALS)를 사용하여 sonication을 2초동안 실시하였다. 잘려진 single strand cDNA 단편을 다시 ethanol down 후 double-strand 5’attB1 adapter을 T4 DNA ligase를 사용하여 ligation시켰다(Table 1). Kit를 사 용하여 cDNA purification을 실시한 후, LA Taq ™ DNA polymerase (Takara)와 attB1-adapter-U를 사용하여 second strand 를 합성하였다(Table 1). 양쪽에 att site를 가지는 cDNA만을 증폭하기 위해 att adapter sequence를 가지는 Biotin-attB2- oligo d(T) primer와 attB1-adapter-U primer를 사용하여 PCR 증폭을 실시하였다. PCR증폭은 initial denaturation 94℃에서 5분간 실시하고, denaturation 94℃에서 45초, annealing 58℃ 에서 45초, extension 72℃에서 1분으로 20cycles을 실시한 후, 마지막으로 extension을 72℃에서 5분간 실시하였다. PCR 결 과는 agarose gel에서 전기영동을 통해 분석하였다. PCR product는 ethanol down 후 pDONR™207 Vector (Invitrogen) 와 BP recombination을 실시하였다. One shot^® Top10 chemically competent cell (Invitrogen)를 사용하여 42℃에서 45초 incubate 후 ice에 2min incubate하여 heat shock transformation을 실시 하였다. Transformation된 sample에 S.O.C 배지를 1 ml 추가한 뒤 37℃에서 1시간 shaking incubate 후 cDNA library를 10^-4까 지 연속 희석 하여 gentamicin (1 μg/ml)을 포함한 LB plate배지 100 μL씩 도말하여 37℃에서 overnight 하였다. Overnight 후 colony를 카운팅하여 titer를 측정하였으며, 랜덤하게 10개의 plasmid를 isolation한 뒤 pDONR 207 F와 pDONR 207 R로 PCR을 실시하여 전기영동을 통해 담배가루이 cDNA library insert 크기를 확인 한 후 적절한 크기의 insert는 sequencing (Macrogen)을 의뢰하여 sequence를 확인하였다.

결과 및 고찰

본 연구에서는 이전의 제한효소를 이용한 cloning방법을 사 용한 cDNA library 제작이 아닌(Leshkowitz et al., 2006), 박테 리오파지 λ의 site-specific homologous DNA 재조합 방식을 응용한 gateway cloning방법을 이용하여 cDNA library를 제작 하였다. 이러한 방법은 담배가루이의 다양한 cDNA를 한번에 간단하게 cloning할 수 있어 cDNA library를 제작하기에 적절 하다. 뿐만 아니라 att site를 가지는 entry clone에 있는 이 담배 가루이 유전자는 att site를 가지는 Destination 벡터라면 어떤 종류의 벡터든 간단하게 cloning이 가능하여 유용하게 사용될 수 있다.

본 연구에서는 VIGS 벡터를 사용하여 담배가루이 RNAi 방 제를 위한 target 유전자를 선발하기 위해 방법을 조금씩 수정 해가며 VIGS vector에 적절한 담배가루이 cDNA library 제작 을 시도하였다.

첫 번째 방법으로, oligo d(T) pimer를 사용하였으며, gateway cloning이 가능하도록 att sequence를 붙여 Biotin-attB2-oligo d(T) primer를 제작하여 first strand를 합성하였다. Size fractionating을 5번 실시 하였으며, 그 중 농도가 좋았던 4번, 5번 fraction tube를 BP recombination을 실시하였다. 그 결과, pDONR 222 vector 부분은 약 2.47 kb에서 밴드가 확인이 되며, BP reaction이 잘 이루어지지 않은 ccdB와 chloramphenicol 저 항성 유전자를 그대로 가지는 background vector의 경우 BsrG Ⅰ을 처리할 경우 1.5 kb와 800 bp에서 밴드 2개가 확인이 되는 데 24개의 밴드 중 2개의 sample에서 background vector가 확 인되었다(Fig. 1). 멀티 밴드가 뜨는 것은 담배가루이 insert내 에 BsrGⅠ영역이 존재하여 뜨는 것으로 추측된다. Background vector를 제외한 나머지 sample의 insert size는 평균 1 kb로 확 인 되었으며, 1 kb를 넘는 큰 size의 insert도 많이 확인되었다 (Fig. 1). 또한 titer 측정 결과, 1.4×10⁴cfu의 titer를 확인할 수 있 었다(Table 2).

두 번째 방법으로, 작은 size의 insert를 만들고자 sonication 을 6초동안 실시하여 mRNA 잘라주었다. 그리고 좀 더 다양한 cDNA를 합성하기 위해 N25 random primer에 att sequence를 추가하여 Biotin-attB2-(N)₂₅ primer를 제작하여 first strand를 합성한 후 9번의 size fractionating을 실시한 뒤 농도가 높은 5 번과 9번 fraction product를 사용하여 BP recombination을 실 시하였다. 그 결과, 총 24개의 밴드 중 8개의 밴드가 확인 되었 으며, background vector는 4개의 sample에서 확인이 되었다. Background vector를 제외한 나머지 sample에서 평균 insert size가 1.54 kb로 확인 되었고, fraction 9번의 경우 12개 sample 모두 insert 밴드가 확인되지 않았다(Fig. 2). 밴드가 확인 되지 않은 것은 single 가닥인 mRNA가 불안정하여 sonication 6초 를 실시할 때 너무 잘게 잘려서 100 bp 이하의 너무 작은 insert 가 삽입된 것으로 추측되며, 5번 fraction에서 몇 개의 큰 size만 확인된 것으로 추측된다. 또한 titer 측정 결과, 1.04×10⁵cfu의 titer를 확인할 수 있었다(Table 2).

세 번째 방법으로는 oligo d(T) primer를 사용하여 first strand cDNA를 합성하였으며, first strand 합성 후 sonication을 2초동 안 실시하였다. 또한 양쪽에 att adapter를 가지는 cDNA만을 증폭시키기 위해 att sequence를 이용해 PCR을 실시하였다. 그 결과, 약 300~600 bp 근처에서 밴드가 희미하게 확인이 되었다 (Fig. 3). Insert가 300~600 bp에서 다양하게 확인되어 명확한 밴드가 아닌 끌리듯 확인이 된 것으로 추측된다. 또한 heat shock으로 transformation을 실시한 후 pDONR 207 vector sequence를 이용하여 제작한 primer로 랜덤하게 10개의 colony를 PCR한 결과, 300~600 bp 사이에서 다양한 insert가 확인 되었 다(Fig. 4). Sequencing 결과 10개 중 3개는 sequencing fail이었 고, 모두 poly A를 가지는 것을 확인 할 수 있었다. NCBI blast search 결과 3개의 sample은 담배가루이 유전자로 확인되었으 며, 나머지 sample은 NCBI에 데이터 정보가 없었다. 그러나 titer 측정 결과, 5.2×10²cfu의 titer로 titer가 매우 낮은 것을 확 인 할 수 있었다(Table 2).

전 연구에서 보면, TRV 벡터를 사용하여 VIGS를 위한 최적 화된 cDNA library에 대해 연구되었다(Liu and Page, 2008). Liu and Page (2008)의 논문에서는 cDNA는 poly A와 같은 homopolymeric regions을 포함해서는 안 된다고 보고되었다. Olig d(T) primer를 사용하여 first strand cDNA를 합성할 경우 insert가 Poly A를 포함하여 특이적으로 silencing이 일어나는 것을 방해한다.

또한 Liu and Page (2008)의 논문에서는 cDNA의 크기는 200 bp 이상이 되어야 하고 최대 1,300 bp를 넘지 않는 것이 좋 다고 보고되었다. Sonication을 실시하지 않을 경우 최대 2 kb 가 넘는 insert 밴드도 확인할 수 있었다. 그러나 sonication을 실시할 경우 insert의 크기가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. mRNA를 sonication 6초를 실시할 경우 mRNA가 불안정하여 100 bp 이하로 잘려 insert 밴드가 확인되지 않는 것으로 추측이 되며, first strand cDNA를 sonication 1초를 실시할 경우 300~600 bp의 적절한 size를 확인할 수 있었다.

또한 transformation방법은 Electro-transformation방법을 사용할 경우 heat shock transformation방법을 사용할 때보다 titer가 10²배 가량 높게 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. Heat shock 보다도 electro transformation 방법이 transformation 효 율이 더 높은 것을 확인할 수 있었다. Background vector를 줄 이기 위해서는 BP recombination시 담배가루이 DNA를 농도 를 농축시킨 후 pDONR vector 보다 더 많은 양을 반응시키면 background vector의 양을 줄일 수 있을 것으로 사료된다.