시스테인 단백질분해효소 억제자(cysteine protease inhibitor: CSI)는 활성부위에 시스테인 아미노산을 보유하는 단백질분 해효소에 대한 억제자로서 적어도 10 개 이상의 분류군으로 구 별된다(Rawlings et al., 2004). 이 가운데 시스타틴(cystatin: CST)은 파파인과 같은 캐셉신(cathepsin) 단백질분해효소에 대한 경쟁적 가역억제자이며 I25의 CSI 분류군에 속하게 된다 (Rawlings et al., 2004). 시스타틴은 아미노산 서열을 기준으로 크게 세 부류로 나뉜다(Rawlings and Barrett, 1990; Turk and Bode, 1991). 제1형 시스타틴(I25A: cystatin A와 sarcocystatin) 은 약 100 개의 아미노산으로 구성된 소형 단백질로 탄수화물 이나 이황화결합이 존재하지 않는다. 제2형 시스타틴(I25B: cystatin C와 phytocystatin)은 약 120 개의 아미노산으로 구성 된 분비형 단백질로 두 개의 이황화결합을 지니게 된다. 제3형 시스타틴(I25C: kininogen)은 혈장 또는 관절액에서 여러 생리 기능의 거대 당단백질을 이루고 있다.

일반적으로 시스타틴은 체내 캐셉신 효소활성을 조절하며, 동물과 식물의 방어단백질로 알려지고 있다(Olsson et al., 1999; Dubin, 2005). 곤충에서도 누에(Bombyx mori)의 경우 캐셉신 을 이용하여 대상 세포에 침입하는 병원체 또는 기생자에 대해 서 시스타틴은 방어물질로서 작용하게 된다(Yamamoto et al., 1999). 더욱이 시스타틴은 단독으로도 항생제 역할을 담당할 수 있다. 투구게(Tachypleus tridentatus)에서는 이 시스타틴이 그람음성세균에 대해서 항생 능력을 보였다(Agarwala et al., 1996). 중증열성혈소판감소증후군 병원 바이러스를 매개하는 작은소참진드기(Haemaphysalis longicornis)에서는 이 시스타 틴이 원생동물 병원체의 증식을 억제하는 항생 효과를 나타냈 다(Zhou et al., 2006).

최초의 바이러스 시스타틴은 폴리드나바이러스(polydnavirus: PDV)의 일종인 Cotesia congregata bracovirus (CcBV)에서 보고되었다(Espagne et al., 2005). 유사한 바이러스 시스타틴 유전자들이 Glyptapanteles indiensis bracovirus, G. flavicoxis bracovirus, C. plutellae bracovirus (CpBV)에서 발견되었다 (Abrahamson et al., 2003; Desjardins et al., 2008; Chen et al., 2011). 이 PDV는 맵시벌 및 고치벌과에 속한 일부 내부기생봉 의 공생바이러스로서 이중나선형 DNA 바이러스 구조를 지니 며 기주 기생봉의 성공적 기생에 필수적 역할을 담당한다(Kim, 2006).

CpBV는 프루텔고치벌(Cotesia plutellae)에 공생하는 PDV 로서, 바이러스 입자에 포함된 게놈은 157 개의 단백질 유전자 를 암호하고 있으며, 이 가운데 시스타틴을 4 개 함유하고 있다 (Kim et al., 2013). 이들 시스타틴 가운데 2 개는 동일한 서열을 나타내어 CpBV-CST1, CpBV-CST2, CpBV-CST3로 구분되 며, 이 가운데 피기생체에서 CpBV-CST2는 발현되지 않고 CpBV-CST1과 CpBV-CST3만 발현된다. CpBV-CST1을 비 기생 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충에 일시발현시킨 결 과 면역억제 및 발육 저하를 가져왔다(Kim et al., 2013). 이러 한 결과는 CpBV-CST1을 이용하여 해충 방제에 이용할 수 있 는 가능성을 제기하였다.

본 연구는 CpBV-CST1을 섭식으로 처리할 경우 해충에 대 한 발육 억제를 유도할 수 있는 지를 분석하기 위해 이 유전자 의 재조합단백질을 형성하였다. 이 재조합단백질이 시스타틴 의 활성을 보이는 지를 조사하기 위해 파파인을 대상으로 단백 질분해활성 억제를 측정하였다. 이를 바탕으로 해충의 면역 및 발육 억제를 단백질 수준에서 분석하여 궁극적으로 해충 방제 의 수단으로 응용하는 데 기초자료를 얻기 위해 진행되었다.

재료 및 방법

시험곤충

배추좀나방(P. xylostella)은 안동시 송천동에 소재한 배추 포장에서 채집한 유충을 약제 처리하지 않고 실내에서 누대 사 육한 것을 사용하였다. 유충은 온도 25±1°C, 광주기 16:8 h (L:D), 상대습도 40 ~ 60%의 조건에서 배추를 먹이로 사육하였다. 성 충은 10% 설탕물을 먹이로 공급하고 배추 잎을 이용하여 산란 을 유도하였다. 파밤나방(Spodoptera exigua)은 배추좀나방과 같은 조건에서 인공사료(Goh et al., 1990)를 이용하여 Seo et al. (2011)의 방법으로 사육하였다.

CpBV-CST1 재조합 발현벡터 클로닝

기존에 클로닝된 CpBV-CST1 cDNA (Kim et al., 2013)를 이용하여 특이적 프라이머(5’-GGAATTCATGTGCAAGGA ATATCGAGTA–3’와 5’-CCGCTCGAGTTAATTTGAATC ATCAATTT-3’: 여기서 밑줄은 EcoRI과 XhoI 인식서열)를 통 해 94°C 30초, 56°C 30초, 72°C 1분 조건으로 35회 PCR을 수 행하여 open reading frame (ORF) 영역을 증폭하였다. 이 PCR 산물을 pCR2.1 클로닝벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 삽입하고 대장균에 형질전환시킨 후, CpBV-CST1의 삽입이 확인된 균총을 선발하였다. 이후 이 선발 균총을 LB-ampicillin 액체배지에서 배양하고 플라즈미드를 분리하여 제한효소 EcoRI 과 XhoI로 절단하였다. 절단된 ORF cDNA를 동일한 제한효소 로 절단시킨 pGEX4T-3 벡터(Invitrogen)에 재조합시키고, 대 장균 BL21 (DE3) 균주에 형질전환하였다. 이후 유전자 서열 분석으로 삽이 부위를 결정한 후 재조합단백질을 형성하는 균 주(BL21/pGEX4T-3-CpBV-CST1)로 사용하였다.

CpBV-CST1 단백질 발현과 분리

소량 배양한 재조합단백질 균주를 LB-ampicillin 액체 배지 에 1/100 비율로 접종한 후 37°C에서 200 rpm으로 배양하여 OD₆₀₀ 0.6-0.8에 이를 때 isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 최종농도 0.5 mM 이 되도록 첨가 후 4 시간 진탕배양 하였다. 이후 12,000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 증식된 세 균을 얻고 여기에 10 mM EDTA와 1% Triton X-100가 포함된 20 mM Tris–HCl (pH 7.5) 완충용액으로 현탁시키고 열변성 처리 후 SDS-PAGE를 실시하여 재조합 단백질의 발현 유무를 대조구와 비교 확인하였다. 응결체(inclusion body)로 형성된 재조합단백질의 refolding을 위해 protein refolding kit (Novagen, Damstadt, Germany, USA)를 이용하였다. 이에 따라 용해된 단 백질을 rCpBV-CST1으로 명명하고 효소 활성 분석 및 생물검 정 시료로 사용하였다.

MALDI-TOF 분석

SDS-PAGE 상에서 분석 대상 단백질 밴드를 절취하여 trypsin으로 가수분해하여 단편화하고, MALDI-TOF (Microflex LRF20, Bruker Daltonics Korea, Seongnam, Korea)에 의한 질 량분석과 PMF (peptide mass fingerprinting) 기반으로 Mascot database (www.matrixscience.com)를 이용하여 단백질을 동 정하였다. MALDI-TOF 분석은 안동대학교 공동실험실습실 에서 이뤄졌다.

시스타틴 효소 활성 분석

rCpBV-CST1 단백질의 단백질분해효소 활성억제 효과를 분석하기 위하여 rCpBV-CST1 단백질 25 µg과 papain 0.6 unit 을 혼합하여 25°C에 10 분간 반응시켰다. 여기에 기질 용액 (30 mM CaCl₂, 0.5 mM N-α-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide, 100 mM Tris-HCl, pH 6.8)을 첨가하여 전체가 200 µl로 채운 후 37°C에서 30 분간 반응시켰다. 이후 30% 빙초산 용액으로 반응을 중지시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정했다. 대조구로 GST (glutathione-S-transferase)를 rCpBV-CST1과 동일한 농 도로 처리하였다.

소낭형성 분석

세포성 면역반응의 일환으로 세균 침입에 따른 혈구의 소낭 형성 반응을 네 종류의 곤충에 대해서 분석했다. 대장균(E. coli Top10)을 LB 배지에서 증식시키고 5 × 10⁴ 세균 세포수를 대상 곤충의 혈강으로 주입하였다. 혈강 주입은 유리 모세관을 이용 하여 초미량펌프가 장착된 미세조정장치(SYS-microcontroller, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)를 이용하여 주입하였다. 유리 모세관은 micropipette puller (PN-30, Narishige, Tokyo, Japan)를 이용하여 제조하였다. 세균이 주입된 유충은 곤충 증식 조건(온도 25±1°C, 광주기 16:8 h (L:D), 상대습도 40~60%)에서 8 시간 배양시켰다. 이후 4°C로 옮긴 후 소낭형 성 반응을 정지시켰다. 이후 각 처리 곤충을 해부하여 형성된 소낭을 해부현미경 50 배 배율에서 관찰했다. 형성된 소낭 수는 먼저 소화관 주변 및 기관지에 붙어 있는 것들을 계수하고, 이 후 소화관을 적출하고 가려진 몸 부위에 존재했던 소낭을 추가 로 계수하여 산출하였다. 각 소낭 분석은 처리 개체를 반복으로 각 처리는 5 마리로 구성되었다.

재조합단백질 생물검정

rCpBV-CST1 단백질을 100 mM 인산완충용액(PBS, pH 7.4) 으로 다양한 농도로 희석하였다. 희석액에 배춧잎(1 cm²)을 10 분간 침지시킨 후 여과지가 깔려진 용기(직경 9 cm)에서 5 분 간 건조시켰다. 각 배추 잎에 갓 부화한 배추좀나방을 10 마리 씩 3 반복으로 처리하였으며, 24 시간 주기로 용화될 때까지 처 리 배추잎을 제공하였다. 이후 형성된 용수와 용화 직후 용무게 를 각각 측정하였다. 대조구는 PBS로 상기와 동일하게 처리하 였다. 용화율 결과는 백분율 자료로서 arsine 변환 후 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1989)을 이용하여 ANOVA 분석 및 처리 평균간 비교를 실시하였다.

결 과

CpBV-CST1 재조합 단백질(rCpBV-CST1) 발현 및 분리

CpBV-CST1의 발현을 위해 약 26 kDa 크기의 glutathione-Stransferase (GST)와 결합된 재조합단백질을 형성하는 pGEX 발현 벡터를 이용하였다(Fig. 1A). 재조합된 발현벡터를 단백 질 발현전용 BL21 대장균 균주를 이용하여 과발현시켰다(Fig. 1B). 형성된 재조합단백질은 응결체로 구성되어 변성 및 재결 합 방식을 이용하여 용해된 순수 단백질을 얻었다. SDS-PAGE 상에서 분리된 단백질은 p37로 추정되었으며, 이를 MALDI-TOF 로 분석한 결과 CpBV-CST1과 일치하였다(Table 1). 그러나 분리된 단백질에 p30 영역에서 부가적으로 과발현된 단백질이 약 5% 정도(단백질 염색 세기 면에서)로 포함되었다. 이 단백 질을 분석하기 위해 MALDI-TOF로 조사한 결과 GST 단백질 서열을 포함하고 있어, 아마도 과발현된 CpBV-CST1의 분해 물 또는 미완성 단백질로 추정된다. 즉, 분리된 rCpBV-CST1 은 95%가 완전한 형태의 재조합단백질을 포함하고 있다는 것 을 의미했다.

rCpBV-CST1의 시스타틴 활성

파파인 단백질 분해효소를 대상으로 rCpBV-CST1의 억제 효과를 분석했다(Fig. 2). 대조구로서 재조합단백질 생성 때 연 결된 GST를 이용하였다. rCpBV-CST1은 대조구에 대비 파파 인 단백질분해능력을 약 75% 이상 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 세균에서 발현한 rCpBV-CST1이 시스타틴의 활성을 지니는 것을 의미했다.

rCpBV-CST1의 곤충면역억제 효과

시스타틴 활성을 지니는 rCpBV-CST1 단백질을 이용하여 곤충 면역반응에 대한 영향을 분석했다(Fig. 3). 비교적 역반 응 연구에 널리 이용되었던 파밤나방을 본 면역반응 연구에 이 용하였다. 세균 주입에 대해서 파밤나방은 8 시간 이내에 체내 에 평균 약 37 개의 소낭을 형성하였다. 그러나 rCpBV-CST1 을 함께 주입하는 경우 소낭형성 반응은 급격하게 줄었다. 특별 히 이 억제 반응은 주입되는 rCpBV-CST1 농도에 따라 증가하 였으며, 조사된 최저 농도 보다 낮은 농도에서 억제를 보일 수 있을 나타냈다.

rCpBV-CST1의 곤충발육억제 효과

재조합단백질 rCpBV-CST1의 섭식에 따른 배추좀나방 발 육 억제에 대한 분석이 이뤄졌다(Fig. 4). 배추좀나방 유충 발육 전체 시기에 대해서 섭식이 이뤄졌으며, 이때 발육된 용화율 및 용무게가 분석에 이용되었다. 이때 대조구로서는 과발현 직전 의 세균배양액으로부터 추출된 단백질을 이용하였다. rCpBVCST1의 처리 농도가 높아짐에 따라 배추좀나방의 용화율 억제 가 나타났다. 처리구에 비해 용화율이 높지만, 대조구에서도 처 리 농도가 높아짐에 따라 다소 용화율이 감소하였다(Fig. 4A). 본 실험 조건에서 번데기로 발육한 개체들은 rCpBV-CST1의 처리에 따라 용무게의 감소를 보였다(Fig. 4B).

고 찰

PDV의 시스타틴은 Cotesia와 Glyptapanteles 두 속에 속한 고 치벌에 공생하는 브라코바이러스에서만 발견되고 있다(Serbielle et al., 2009). 시스타틴은 파파인과 같은 캐셉신 효소의 작용에 대한 경쟁적 가역억제자이다(Turk et al., 1997; Abrahamson et al., 2003). 캐셉신은 비활성 전구체로 합성되어 아미노 말단 부 위가 분해되면서 활성화된다(Lecaille et al., 2002). 곤충에서는 네 종류의 캐셉신류(B, L, F, 26/29 kDa)가 보고되었다(Kurata et al., 1992; Attardo et al., 2006). 캐셉신은 발육(Homma et al., 1994; Cho et al., 1999; Uchida et al., 2001; Hegedus et al., 2002), 소화(Koo et al., 2008), 해독작용(Shindo and Van Der Hoorn, 2008) 및 면역작용(Saito et al., 1992; De Gregorio et al., 2001; Levy et al., 2004) 등 다양한 생리 작용에 관여한다. 따라서 바이러스 유래 시스타틴에 의해 피기생체의 캐셉신 활 성을 교란하는 것은 피기생체 기주에게는 불리하지만, 숙주 기 생봉에는 유리한 환경을 초래할 수 있다. 본 연구 결과는 이러 한 가설을 뒷받침해여 주고 있다.

첫째로, 재조합단백질인 rCpBV-CST1은 시스타틴 활성을 보였다. 즉, rCpBV-CST1을 첨가할 경우 파파인 효소의 단백 질분해 능력을 약 75% 이상 억제하는 효과를 나타냈다. 그러나 다른 종류의 캐셉신에 대한 억제 능력은 본 연구에서 밝혀지지 않았다. 본 CpBV-CST1과 유사한 시스타틴이 CcBV에 존재하 고, 이 시스타틴(CST1)이 Manduca sexta의 26/29 kDa 캐셉신 을 억제하는 것으로 제시하였다(Serbielle et al., 2009). 아직 배 추좀나방의 캐셉신은 분석되지 않았으나, CpBV-CST1도 피기 생체의 캐셉신을 억제할 수 있을 것으로 본 연구 결과는 의미하 고 있다.

둘째로, rCpBV-CST1 단백질은 파밤나방의 소낭형성 면역 반응을 억제하였다. 혈구 소낭형성 반응은 세포성 면역반응의 일환으로 비교적 다수로 침입한 소형의 병원체에 대해서 혈구들 이 연합하여 병원체의 증식을 막는 반응이다(Lavine and Strand, 2002). 나비목의 경우 소낭형성은 먼저 과립혈구에 의해 인식 되고, 이후 부정형혈구의 혈구 활착 반응 및 멜라닌형성 반응에 의해 이뤄지게 된다(Ratcliffe and Rowley, 1979). Song et al. (2008)은 프루텔고치벌의 기생에 따라 배추좀나방의 캐셉신 B 형의 단백질 수준이 올라간다고 보고하였다(Song et al., 2008). 일반적으로 캐셉신은 세포내 라이소좀에 위치하고 있고, 특별한 조건에서 세포 밖으로 방출되게 된다(Brix et al., 2008). 세포 밖으로 방출된 캐셉신은 extracellular matrix (ECM)를 분해 및 재구성에 관여하거나 사이토카인 또는 보체(complement)를 분 해하는 기능을 담당한다(Dickinson, 2002). 쉬파리류(Sarcophaga peregrina)가 분비하는 캐셉신 L형은 유충의 멜라닌을 유기하 는 데, 이는 간접적 영향으로캐셉신의 기저막 단백질 분해에 의 한 혈구세포의 멜라닌반응으로 해석되어 진다(Tang et al., 2007; Li et al., 2008). 흥미롭게도, C. marginiventris에 기생된 Heliothis virescens에 이 캐셉신 L을 처리한 결과 멜라닌반응 이 일어나지 않았다(Nusawardani et al., 2005). 즉, 이 기생봉이 지니는 PDV에 의해 시스타틴이 발현되어 방출되어 캐셉신 L 의 멜라닌 유기 반응을 억제한 것으로 해석된다. 따라서 프루텔 고치벌 기생에 따라 캐셉신 B가 방출되더라도 CpBV-CST류 에 의해 활성이 억제되어 기생봉(또는 바이러스)을 공격하는 멜라닌반응에 대처하게 된다고 해석된다. 따라서 직간접적으 로 소낭형성에 영향을 주는 캐셉신에 대해서 rCpBV-CST1의 억제 작용에 의해 면역반응이 줄어든 것으로 해석된다.

셋째로, rCpBV-CST1 단백질의 섭식 처리는 배추좀나방의 유충 발육 및 용화로의 변태를 억제하였다. 일부 높은 농도 처 리의 대조구에서 나타난 억제효과는 본 연구에서 사용된 대조 구가 IPTG로 가발현하지 않은 동일한 세균 추출액으로 일부 rCpBV-CST1의 발현이 진행된 것으로 해석된다. 이러한 rCpBVCST1의 억제효과 이 단백질이 소화관 내에 존재하는 캐셉신 소화효소에 대한 직접적 억제 작용으로 해석해 볼 수 있다. 즉, 단백질 분해효소로서 캐셉신에 대한 억제 작용은 영양소 결핍 으로 이어져 유충 발육 억제를 초래할 수 있다. 다음으로 캐셉신 에 의해 진행되는 곤충의 탈피과정이다. 왕담배나방(H. armigera) 의 경우 캐셉신 L이 탈피 때 발현이 증가하고 이 캐셉신 활성을 억제할 경우 탈피가 억제된다는 사실을 밝혔다(Liu et al., 2006). 캐셉신의 탈피과정 관여는 표피층분리 또는 탈피 행동에서 단 백질 분해 기능의 필요성으로 이해되고 있다. 또한 이 캐셉신 L 의 활성은 변태 과정 동안 조직 재분화에 관여하는 것으로 나타 났다(Zhang et al., 2013). 유충 말기에서 용기간 동안 완전변태 류의 경우 지방체를 포함한 다양한 유충 조직이 성충 조직으로 재분화가 일어나고, 이 과정에서 ECM의 재구성이 필요하게 된다(Haunerland and Shirk, 1995). 변태 과정 중 엑다이손 호 르몬의 영향에 의해 Relish 전사인자를 발현 및 유기시키고, 이 인자는 다시 캐셉신 L의 발현 및 세포외 방출을 유도하고, 이 효 소는 ECM의 분해 및 재구성을 유도하게 된다(Zhang et al., 2013). 따라서 처리된 rCpBV-CST1은 세포외에서 작용하는 캐셉신에 억제 작용을 통해 유충 기간 탈피와 용화 과정동안 조 직 재구성을 막아 발육을 억제하는 것으로 해석된다. 그러나 이 후자의 설명은 rCpBV-CST1이 소화관 벽을 통과하여 혈강으 로 흡수되었다는 가정 하에서 일어나는 것으로 이에 대한 후속 연구가 필요하다.

이상의 결과는 재조합단백질 rCpBV-CST1이 시스타틴 활 성을 보이며 곤충의 면역 및 발육을 억제하는 기능을 가지고 있 다는 것을 보여 주었다. 특별히 이 단백질의 섭식 처리에 의해 대상 곤충의 발육 억제 효과는 이 단백질을 이용한 해충 방제의 응용 가능성을 제시하고 있다. 즉, 이 단백질을 발현하는 재조 합 벡큘로바이러스 또는 형질전환작물로 응용이 가능할 것으 로 예상된다.