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식물은 초식동물이나 병원균의 공격으로부터 자신을 보호 하기 위해 직․ 간접적으로 다양한 방어 전략을 발전시킨다 (Mattiacci et al., 2001; Hartmann 2004). 초식동물이 유도한 식 물유래 휘발성물질은 포식성 및 기생성 천적이 기주나 먹이를 찾는 행동에 중요한 역할을 한다(Dicke, 1999; Turlings and Wäckers, 2004). 식물유래 휘발성물질 방출 정도는 초식동물의 종, 나이, 환경조건 등에 따라 다르다(Gouinguené and Turlings, 2002; Gouinguené et al., 2003). 초식동물이 유도한 식물유래 휘발성물질은 식물이 초식동물에 의해 공격을 받았을 때 많은 양이 방출되기 때문에 먹이를 찾고 있는 천적들에게 쉽게 탐지 된다(Dicke, 1999).
풀잠자리류는 주요 해충을 포식하는 중요한 천적중의 하나 로(New, 1988) 식물-해충-천적의 체계에서 기주식물이 분비한 휘발성물질(Zhu et al., 2005), 초식동물이 유도한 식물휘발성 물질(James, 2003; { label needed for ref[@id='R12'] }James and Price, 2004) 및 진딧물 성페로몬 (Boo et al., 1998; Hooper et al., 2002) 등을 포함한 다양한 통신 물질들(semiochemicals)에 이끌리고, 특히 일부 풀잠자리는 개 박하(Nepeta cataria L)에서 발견된 nepetalactone과 nepetalactol 에 잘 이끌린다(McElvain et al., 1941).
풀잠자리류 중 가장 흔한 칠성풀잠자리(Chrysopa cognata Wesmael)는 진딧물을 선호하는 경향을 갖고 있는 특성으로 인 해 생물적 방제인자로서 포식성 천적류인 풀잠자리를 화학농 약 대신 사용하는 것이 친환경적인 방제 수단이 되고 있다. 그 러나 대량 사육에서 방사하기까지 많은 요인들을 고려해야 하 는 어려움이 있고, 포식성 천적을 이용하여 성공하기 위해서는 해충의 밀도가 증가하기 전에 천적 밀도를 유지하거나 낮은 해 충의 밀도에서도 천적의 밀도를 유지해야 하는 어려움이 있다. 이러한 어려운 현실을 극복하기 위한 대안적 수단으로 외부로 부터 포장 안으로 천적을 유인하는 것도 시도해 볼 수 있는 효 과적인 방제전략이 될 수 있다.
따라서 본 연구에서는 풀잠자리를 유인할 수 있는 휘발성물 질을 개발하기 위한 기초단계로 목화진딧물(A. gossypii)을 접 종한 착색단고추(C. annuum L.)에서 방출된 휘발성물질 및 칠 성풀잠자리(C. cognata) 암컷이 분비한 휘발성물질에 대한 칠 성풀잠자리 수컷의 반응을 조사하였다.
재료 및 방법
시험곤충 및 화합물
칠성풀잠자리(C. cognata) 유충 및 성충을 경기도 수원 소재 서울대학교 수목원에서 채집하여 사육실(온도 25±1°C, 상대습 도 60±10% 및 광주기 16L: 8D)로 가져와 각각 사육상자(30 × 30 × 30 cm)에 넣어 두고 오이(Cucumis sativus L.) 유묘에 붙 어 있는 목화진딧물(Aphis gossypii Glover)을 먹이로 공급하 였다. 본 연구에 사용된 화합물은 로담스테드 연구소(Rothamsted Research, UK)로부터 공급 받아 사용하였다. 3-ethylacetophenone, 4-ethylacetophenone, 3-ethylbenzaldehyde, 4-ethylbenzaldehyde 는 착색단고추에 목화진딧물을 접종한 후 48시간 동안 포집, (Z,Z)-4,7-tridecadiene, (Z)-4-tridecene, (Z)-4-undecene은 우 화 후 2일된 칠성풀잠자리로부터 48시간 동안 포집하여 확인∙동정된 물질이다.
유인행동검정
유인행동은 glass Y-tube olfactometer(stem 3.5 × 20 cm, arm 3.5 × 20 cm)를 이용하여 검정하였다. 각 arm에 냄새를 보 낼 수 있는 유리통(직경 13 cm × 높이 21 cm)이 연결되어 있고, 각 arm으로 정제한 공기(400 ml/min)를 넣어 주었다. 빛에 의 한 시각적 방해를 배제하기 위해 Y-tube olfactometer의 arm을 쿠킹 호일로 덮어 주었고, 또한 Y-tube olfactometer의 방향에 따른 오류를 배제하기 위해 180°방향을 바꿔 가면서 유인행동 을 검정하였다.
처리구는 목화진딧물만 있는 것, 착색단고추(C. annuum L.) 만 있는 것, 착색단고추에 목화진딧물 100마리 이상을 접종한 것으로 구분하였고, 대조구는 정제한 공기만 공급해 주었다. 칠 성풀잠자리 암컷에 대한 칠성풀잠자리 수컷의 반응을 조사하 기 위해서 처리구에는 칠성풀잠자리 암컷 10마리를 넣고, 무처 리구를 대조로 하여 유인행동을 검정하였다. 칠성풀잠자리 성 충을 Y-tube olfactometer 주 arm의 5 cm 이내에 놓고, 10분 동 안에 Y자로 나누어지는 지점에서부터 12 cm 이상 이동한 것을 반응한 것으로 간주하고 계수하였고, 어느 쪽도 움직임이 없는 것은 무반응으로 처리하였다. 모든 유인행동 검정시험은 낮 기 간에 수행되었다.
휘발성물질 포집
목화진딧물을 접종한 착색단고추로부터 방출되는 식물휘발 성물질을 포집하기 위해 목화진딧물 약충과 성충을 100마리 이상을 착색단고추에 접종하고 포집기(Porapak-Q)로 48시간 동안 포집하였다. 착색단고추만으로부터 방출되는 식물휘발 성물질 포집도 동일한 포집기를 이용하여 48시간 동안 포집하 였다. 포집은 closed push/pull system을 이용하여 glass dome 챔버(높이 15 cm × 직경 16 cm)에 목화진딧물을 접종한 착색단 고추를 넣은 후 charcoal 필터를 통해 정제한 공기를 넣어 주고 (3 L/min), 포집기(Porapak-Q)를 통해 분당 0.8 L 압력으로 공 기를 빼 내면서 포집하였다. 포집기는 사용하기 전에 질소 가스 를 유입시키면서 150°C에서 12시간 가열하여 불순물이 없도 목화진딧물을 접종한 착색단고추로부터 방출되는 식물휘발 성물질을 포집하기 위해 목화진딧물 약충과 성충을 100마리 이상을 착색단고추에 접종하고 포집기(Porapak-Q)로 48시간 동안 포집하였다. 착색단고추만으로부터 방출되는 식물휘발 성물질 포집도 동일한 포집기를 이용하여 48시간 동안 포집하 였다. 포집은 closed push/pull system을 이용하여 glass dome 챔버(높이 15 cm × 직경 16 cm)에 목화진딧물을 접종한 착색단 고추를 넣은 후 charcoal 필터를 통해 정제한 공기를 넣어 주고 (3 L/min), 포집기(Porapak-Q)를 통해 분당 0.8 L 압력으로 공 기를 빼 내면서 포집하였다. 포집기는 사용하기 전에 질소 가스 를 유입시키면서 150°C에서 12시간 가열하여 불순물이 없도 Behavioral response of the lacewing Chrysopa cognata 9 록 준비하였다. 칠성풀잠자리로부터 휘발성물질을 포집하기 위해 glass dome 챔버(높이 15 cm × 직경 16 cm)에 암수(우화 후 2일된 성충) 10마리를 각각 다른 챔버에 넣어 두고 포집기를 이 용하여 칠성풀잠자리로부터 분비되는 휘발성물질을 48시간 동안 포집하였다. 포집된 포집기는 750 μl의 distilled diethyl ether로 추출하고 시험에 사용할 때까지 –20°C에 저장하였다.
GC-EAD 분석
목화진딧물 감염 식물성휘발물질 및 칠성풀잠자리 유래 휘발 성물질에 대한 칠성풀잠자리의 반응을 가스크로마토그래피가 부 착된 촉각전도측정장치(gas chromatography-electroantennographic detection, GC-EAD)를 이용하여 분석하였다. 가스크로마토그 래피(HP 6890)에는 FID 검출기와 DB-WAXetr column(30 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 ㎛ film thickness, J&W Scientific, Folsom, CA, USA)이 장착되어 있으며, 헬륨을 운반가스로 사 용하였다. splitless 모드에서 1 μl의 시료를 주입하였다. GC 오 븐 온도는 시료 주입 후 50°C에서 2분간 유지하다 분당 10°C씩 증가시켜, 최종 240°C까지 승온 후 10분간 유지하였다. 컬럼으 로 들어 와 분석된 시료는 Y-connector(Quartz splitter, Agilent Technologies, Part no. 5181-3397)에 의해 1:1로 나뉘어 한쪽은 FID, 다른 한쪽은 EAD로 흘러간다. EAD 쪽에는 칠성풀잠자리 안테나의 습도를 유지해 주기 위해 0.5 m/sec 속도로 습한 공기 를 흘러 보내 주었다. EAD는 data acquisition interface(Serial IDAC-232)가 부착되어 있는 개인용 컴퓨터의 Syntech EAG 2000 program(Hilversum, The Netherlands)으로 측정하였다.
GC/GC-MS 분석
포집된 시료는 FID 검출기를 부착한 Agilent 6890 GC에 극 성(DB-wax, 30 m × 0.32 mm i.d. × 0.5 m film thickness)과 HP5890 GC에 비극성 칼럼(HP-1, 50 m × 0.32 mm i.d. × 0.5 m film thickness)으로 각각 분석하였다. GC 오븐 온도는 시료 주 입 후 1분간 40°C를 유지하기 시작하여 분당 5°C씩 150°C까지 증가시켰고, 이후 분당 10°C씩 최종 250°C까지 승온시켰으 며, 수소를 운반가스로 사용하였다. 표준화합물과 비교하여 ChemStation software(Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA)로 시료를 정량하였다.
GC-MS 분석은 HP 5873N mass selective detector가 부착된 6890 GC-MS를 이용하여 칼럼은 HP-1MS(30 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 μm film thickness)를 사용하였다. 최초 0.5분 동안 35°C 로 유지하여 분당 12°C씩 증가시켜 최종 180°C까지 도달시켰 다. 표준화합물의 머무름 시간 지수 및 질량 스펙트럼을 시료와 상호 비교하여 동정하였다.
야외포장 생물검정
칠성풀잠자리 유인효과시험은 2005년부터 2006년까지 서 울대학교 수목원에서 수행하였다. 화합물질 방출기로 흰색 고 무(septa, cat. # Z10,072-2, Aldrich Chemical Co. Ltd.), 포획장 치는 윙트랩(Green Agrotech Co.)을 사용하였다. 트랩은 5 m 간격으로 지상에서 1.5 m 높이에 설치하였으며, 매주 윙트랩의 끈끈이를 교체하면서 유인된 칠성풀잠자리 수를 조사하였다.
착색단고추에 목화진딧물을 접종하고 48시간 동안 포집하 여 GC-EAD에서 확인된 피크로부터 동정된 3-ethylacetophenone (3APO), 4-ethylacetophenone(4APO), 3-ethylbenzaldehyde (3EBL) 및 4-ethylbenzaldehyde(4EBL)를 100 μl 헥산에 0.01, 0.1, 1 및 5 mg씩 녹여 조제한 방출기의 효과를 2006년 8월 28 일부터 9월 18일까지 조사하였다. 아울러 3EBL과 4EBL, 3APO와 4APO를 각 2 : 1의 비율로 전체 5 mg이 되도록 조제 하여 유인효과를 조사하였다. 이때 대조구로 100 μl 헥산에 nepetalactol 0.1 mg을 녹여 조제한 루어를 사용하였다.
100 μl 헥산에 5 mg의 3APO, 4APO, 3EBL 및 4EBL을 녹 여 조제한 루어, 3EBL과 4EBL, 3APO와 4APO를 각 2 : 1의 비 율로 전체 5 mg이 되도록 조제한 루어와 1 mg의 nepetalactol을 녹여 조제한 루어를 윙트랩에 동시에 매달아 놓고 2006년 9월 13일부터 10월 2일까지 칠성풀잠자리 유인효과를 조사하였다.
2일된 칠성풀잠자리 암컷 성충에서 포집하여 동정한 (Z)-4- tridecene, (Z)-4-undecene, (Z,Z)-4,7-tridecadiene의 유인효과 를 조사하였다. Z-4-tridecene 및 Z-4-undecene을 0.1, 1 및 10 mg을 100 μl 헥산에 녹여 조제한 루어의 효과를 서울대학교 수 목원에서 2005년 8월 10일부터 9월 6일까지 조사하였다. (Z,Z)-4,7-tridecadiene은 0,0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 5 mg을 녹여 조제한 루어의 효과와 여기에 nepetalactone을 0.1 및 1 mg을 녹여 조제한 루어, 그리고 nepetalactol 0.1 mg을 녹여 조 제한 루어를 동시에 매달아 놓고 유인효과를 조사하였다.
통계분석
유인행동 검정에서 칠성풀잠자리의 행동적 반응 차이는 χ2 - 검정으로 분석하였고, 야외포장에서 트랩 포획수의 통계적 유 의성은 LSD 검정(P < 0.05)으로 분석하였다.
결과 및 고찰
유인행동검정
목화진딧물 단독, 착색단고추 단독, 착색단고추에 목화진딧 물을 접종한 각각에 대한 칠성풀잠자리의 선택 행동시험을 수 행한 결과(Fig. 1), 칠성풀잠자리 성충은 목화진딧물에 대한 뚜 렷한 선호성을 보이지 않은 반면 착색단고추에 대해 강한 선호 도(χ2 = 75.0, df = 1, P < 0.0001)를 보였고, 착색단고추에 목화 진딧물을 접종한 것에 대해서도 강한 선호도(χ2 = 42.9, df = 1, P < 0.0001)를 보였다. 또한 칠성풀잠자리는 착색단고추에 비 해 착색단고추에 목화진딧물을 접종한 시험구에 상대적으로 더 강한 선호도를 보였다(χ2 = 75.0, df = 1, P < 0.0001). 이러한 결과는 무당벌레(Harmonia axyridis Pallas)가 진딧물이 감염 되지 않은 잎에서 방출되는 냄새보다 진딧물이 감염된 잎에서 방출된 냄새에 더 강하게 유인되었다는 보고와 일치되는 결과 이다(Obata, 1986). 그러나 Obata(1986)는 무당벌레의 이끌림 현상이 진딧물 때문인지 진딧물의 가해에 의해 유도된 식물이 반응한 결과 때문인지는 정확하게 결론을 내리기 힘들다고 하 였다. 칠성풀잠자리 수컷 성충은 암컷 성충에 대해서도 유의성 있는 이끌림 현상을 보였다(Fig. 2, χ2 = 17.1, df = 1, P < 0.0001). 본 연구에서 착색단고추에 목화진딧물을 접종한 것으 로부터 방출된 냄새 및 칠성풀잠자리 암컷으로부터 방출된 냄 새에 대해 칠성풀잠자리가 강한 선호성을 보이는 것으로 보아 칠성풀잠자리를 유인할 수 있는 특정 휘발성물질이 있을 것으 로 추정되었다.
GC-EAD/GC-MS 분석
목화진딧물을 착색단고추에 접종한 후 48시간 포집한 것에 대한 칠성풀잠자리 암컷 성충의 GC-EAD 반응에서 일치된 주 요 피크는 영국 로담스테드 연구소에서 개발한 GC-coupled NMR spectroscopy 방법에 의해 15종의 휘발성물질(Fig. 3), 우 화 후 2일된 칠성풀잠자리 암컷 성충을 48시간 포집한 것에 대 해 칠성풀잠자리 수컷 성충의 GC-EAD 반응을 보인 피크로 5 종의 휘발성물질이 동정되었다(Fig. 4). 한편 칠성풀잠자리 수 컷 성충을 48시간 포집하여 칠성풀잠자리 암컷에 대해서 GCEAD 반응을 조사하였으나 뚜렷하게 일치된 피크를 확인하기 어려웠다.
야외포장 생물검정
위에서 동정된 4-ethylacetophenone, 3-ethylbenzaldehyde, 3-ethylacetophenone 및 4-ethylbenzaldehyde에 대한 칠성풀잠 자리의 행동반응을 검정한 결과(Table 1), GC-EAD 반응을 보인 것과는 다르게 뚜렷한 유인효과를 확인하지 못하였다. Acetophenone은 ,Dendroctonus pseudotsugae 암컷(Conn et al., 1983) 및 Taphrorychus bicolor 수컷(Kohnle et al., 1987)으로 부터 동정된 휘발성물질로 D. pseudotsugae 암컷의 유인을 억 제하고, T. bicolor의 aggregation을 자극한다. Sullivan(2005)은 acetophenone이 Dendroctonus frontalis 수컷의 유인을 현저하게 감소시켰다고 보고한바 있다. 그러나 본 연구에서 acetophenone 종류인 4-ethylacetophenone 및 3-ethylbenzaldehyde 단독으로 는 칠성풀잠자리를 유인하지 못하였지만, nepatalactol의 유인 력을 증가시켰다(Fig. 5).
GC-EAD 분석에서 안테나 반응을 보인 (Z)-4-tridecene 및 (Z)-4-undecene은 야외 포장에서는 칠성풀잠자리를 유인하는 효과를 보여 주지 못하였다(Table 2). Wadhams(1990)는 black bean aphid(Aphis fabae)의 single cell recording 결과, (E2)- hexanal 성분을 포함하고 있지만 행동반응을 측정했을 때 활성 을 갖지 못하였다고 보고하였다. 체체파리(Glossina morsitans) 의 EAG-active compound 중에 일부 성분(1-octen-3-ol, 4- methyphenol 및 3-proylphenol)은 유인물질로 작용하지만, 일 부 성분(acetophenone, 2-methoxyphenol)은 기피물질로 작용 하고, 그리고 일부 성분(2,6,10,10-tetramethyl-1-oxaspiro[4.5] dec-2-en-8-one)은 행동적 활성을 전혀 보이지 않는 경우도 있 다(Gough et al., 1987; Bursell et al., 1988; Kappmeier and Nevill, 1999). 전기생리학적으로 활성이 있는 화합물이 항상 행동학적인 활성을 나타낸다고 할 수 없듯이(Bjostad, 1998), Y-tube olfactometer를 통해 유인성이 확인되었고, GC-EAD 분석에서 안테나 반응을 보였다고 해서 야외에서 반드시 유인 효과는 나타내는 것은 아님을 알 수 있었다. 따라서 실내와 야 외에서 불일치되는 결과는 예를 들어 single sensillum 수준에 서 반응성, 야외포장에서 여러 가지 외적 요인들에 대한 연구 등 앞으로 추가적으로 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
(Z,Z)-4,7-tridecadiene 단독으로도 칠성풀잠자리에 대한 유 인효과를 보여주지 못했을 뿐만 아니라 nepetalactol의 유인효과 를 현저하게 감소시켰다(3). Zhu et al.(2000)은 Chrysoperla carnea 암수의 추출물과 Peyerimhoffina gracilis 수컷의 포집물 에 (Z,Z)-4,7-tridecadiene이 보조 성분으로, (Z)-4-tridecene이 주 성분으로 포함되어 있다고 보고하였다. 특히, (Z)-4-tridecene 은 Chrysoperla rufilabris(Zhang et al., 2004)와 Chrysoperla carnea(Zhu et al., 2000)의 횽부 추출물로서 암수 모두의 안테 나를 자극하는 화합물로도 알려져 있다. P. gracilis는 실내검정 에서 (Z)-4-tridecene에 대해 안테나 반응을 보였으나, 야외 포 장에서는 수컷 P. gracilis에 대해 neomatatabiol의 유인력을 현 저하게 감소시켰다. 이러한 결과로 볼 때 유인물질에 대한 (Z,Z)-4,7-tridecadiene의 억제 효과는 풀잠자리과(Chrysopidae) 에서 나타나는 특징적인 현상으로 보여 진다.
이상의 실내외 시험결과들을 바탕으로 3-ethylbenzaldehyde 와 4-ethylacetophenone는 nepetalactol과 혼합사용을 통해 칠 성풀잠자리를 유인하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 본다.
KSAE
