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 복숭아순나방(Grapholita molesta Busck, the oriental fruit moth)은 원래 우리나라를 비롯하여 동북아시아에 분포하던 과수해충으로(Machida and Aoyama, 1931), 20세기 초반에 미국으로 건너간 이래로 현재는 아메리카, 유럽, 아프리카, 오스트레일리아 등 전세계의 온대 및 아열대 지역에 분포하고 있다(Rothschild and Vickers, 1991). 복숭아순나방은 장미과(Rosaceae)에 속하는 식물을 가해하는 협식성 곤충으로, 미국과 유럽에서는 복숭아가 주요 기주식물이고 사과와 배가 2차 기주식물로 알려져 있다(Rothschild and Vickers, 1991; Najar- Rodriguez et al., 2013). 우리나라에서도 주로 복숭아의 해충으로 여겨져 오다가 1990년대에 배 과원에 많은 피해를 주었으며(Yang et al., 1995; Yang et al., 2001), 2000년대에 들어서는 사과의 주요 해충으로 관심을 받게 되었다(Choi et al., 2008). 그런데, 최근 유사종인 복숭아순나방붙이가 복숭아순나방과 함께 발생한다는 보고가 있어(Choi et al., 2009; Jeong et al., 2012; Jung et al., 2012), 해당종의 발생이 확대 해석되어왔을 가능성이 제기된 바 있다(Jung et al., 2012).

 복숭아순나방붙이(Grapholita dimorpha Komai, the plum fruit moth)는 일본(Komai, 1979)에서 처음 보고된 이래, 한국(Park and Kim, 1986), 중국(Yan et al., 1999), 러시아(Beljaev and Ponomarenko, 2005) 등에서도 보고되면서, 현재 동북아시아 지역에 국한하여 발생하는 것으로 보인다. 복숭아순나방붙이의 기주범위는 복숭아순나방의 기주범위와 유사하게 핵과류 과수를 주로 가해하는 것으로 알려져 있다(Rothschild and Vickers, 1991). 일본에서는 자두와 사과에 문제를 일으키는 것으로 보고되었으며(Komai, 1979; Yoshizawa, 2008), 우리나라에서는 사과에 피해를 주는 것이 처음으로 보고된 이래(Choi et al., 2009), 최근 배과원과 자두과원에서도 복숭아순나방붙이의 발생이 보고되었다(Jeong et al., 2012; Jung et al., 2012). 현재 상용화된 성페로몬 트랩을 이용하여 두 유사종을 따로 예찰하는 방법을 사용하고 있으나, 교차유인으로 인해 두 종의 발생빈도와 발생밀도를 정확히 예측하기 어려운 실정이다(Jung et al., 2012). 성페로몬 트랩 결과만으로는 과수에 피해를 준다는 직접적인 증거가 될 수 없기 때문에, 두 유사종이 실제로 어떻게 피해를 주는지에 대한 직접적인 연구가 필요한 실정이다.

 이를 위해, 본 연구에서는 (1) 두 유사종을 대상으로 유충 상태에서도 구별할 수 있는 분자동정법을 개발하였고, (2) 복숭아와 자두나무에서 복숭아순나방류의 피해를 받은 것으로 보이는 신초와 과실을 채집하여 분자동정법으로 두 유사종을 구별하였다. 이를 통하여 복숭아와 자두에서 두 종의 직접적인 가해 여부를 확인하였고, 기주에 따른 두 종의 발생 비율을 조사하여 가해 특성의 차이를 알아보았다.

재료 및 방법

피해순 및 피해과로부터 해충 채집

2013년에 복숭아(화성, 수원, 음성)와 자두(화성, 수원, 김천) 과원에서 복숭아순나방류의 피해를 받은 것으로 보이는 신초와 과실을 채집하였다(Table 2). 수거해온 피해순에서 유충을 찾아내어 개체별로 마이크로 튜브에 담았고, 피해과는 25℃ 및 16L:8D 조건에 두고 성충이 우화할 때까지 기다렸다가 복숭아순나방류로 보이는 성충을 개체별로 마이크로 튜브에 담았다. 튜브에 담긴 유충 또는 성충 개체 시료는 분자동정을 위해 바로 DNA를 추출하거나, 추출할 때까지 –20℃에 보관하였다.

Table 2. Field collection and identification of the two species, G. molesta and G. dimorpha, from shoots and fruits in peach and plum orchards in 2013

종 특이적 프라이머 제작

 NCBI에 등록된 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이의 미토콘드리아 COI 유전자 서열을 각각 확보하여(GenBank accession numbers: HQ538466.1 and AB603522.1), ClustalW 방법으로 서열을 정렬하여 비교하였고, Primer3 소프트웨어(Untergrasser et al., 2012)를 이용하여 두 서열간에 차이가 나는 부위를 중심으로 두 종 각각에 대한 종 특이적 forward 및 reverse 프라이머를 설계하였다(Fig. 1). 복숭아순나방 특이적 프라이머로 GrapM428-F와 GrapM-R을, 복숭아순나방붙이 특이적 프라이머로 GrapD428-F와 GrapD-R을 ㈜바이오니아에 의뢰하여 합성하였다.

Fig. 1. Alignment of partial mtCOI DNA sequences from G. molesta (HQ538466.1) and G. dimorpha (AB603522.1). Asterisk (*) under the alignment indicates a polymorphic site of the nucleotide between two sequences. Forward and reverse primers used in this study are shown in open boxes.

복숭아순나방과 복숭아순나방붙이의 분자동정

 1.5 ml 마이크로 튜브에 들어있는 개체를 작은 모터가 달린 균질기를 이용하여 마쇄한 후, AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 두 유사종의 구별을 위해 개발한 종 특이적 프라이머 세트를 각각 따로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다(Table 1). PCR 반응액은 추출한 DNA template 1 µl, 프라이머 각각 1 µl씩, 증류수 38 µl, 10 mM dNTP 1.5 µl, 25 mM MgCl2 2 µl, 10 × PCR buffer 5 µl, Taq polymerase 0.5 µl (2.5U)로 제작하였으며, thermal cycler (PCR Thermal Cycler Dice, TaKaRa, Japan)를 이용하여 다음과 같은 PCR 반응을 수행하였다. 94℃에서 2분간 초기 불활성화 후, 94℃에서 1분, 61℃ (복숭아순나방) 또는 65℃ (복숭아순나방붙이)에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 증폭과정을 35회 반복하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 사슬연장 반응을 실시하였다. PCR 산물은 loading dye로 염색한 후, 2% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.

Table 1. PCR primer sets used to amplify mitochondrial COI region of Grapholita molesta and G. dimorpha

통계분석

 복숭아와 자두의 신초와 과실 각각에 대해 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이의 발생 차이를 확인하기 위해, 두 곤충의 발생 빈도수를 이용하여 Χ² 검정을 실시하였다(SAS Institute, USA).

결 과

분자동정

 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이 미토콘드리아 COI 부위에 대해 종 특이적인 프라이머와 반응조건을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 두 프라이머 조합과 각각의 annealing 온도조건에서 종 특이적인 반응산물을 만들었다. 두 가지 PCR 반응산물은 모두 427 bp로 단편의 길이가 같지만, 반응조건(annealing 온도)에 따라 PCR 반응의 성공 여부가 결정되는 종 특이적인 결과를 보였다(Fig. 2).

Fig. 2. PCR products of partial mitochondrial COI sequences amplified by the species-specific diagnostic primers for the two species, G. molesta (Gm) and G. dimorpha (Gd). Demonstrative PCR amplifications were performed either with Gm-specific (A) or with Gd-specific (B) diagnostic primers.

신초 및 과실 가해 종

 복숭아와 자두에서 신초와 과실을 가해하는 복숭아순나방류를 채집하여 앞에서 개발한 분자동정법을 이용하여 두 종의 발생 비율을 각각 조사한 결과, 복숭아의 경우 신초와 과실 모두 복숭아순나방이 주로 가해하는 것으로 나타났다. 복숭아 신초에서 발견된 유충은 모두 복숭아순나방이었으며, 과실을 가해하는 것도 대부분(92.5%) 복숭아순나방이었다. 반면에, 자두의 경우 신초는 모두 복숭아순나방이 가해하는 것으로 나타났으나, 과실은 주로(97.0%) 복숭아순나방붙이가 가해하였다(Table 2).

고 찰

 본 연구는 유사종인 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이의 분자동정법을 개발하고, 이 방법을 복숭아와 자두 과원에 발생하는 두 종의 구별에 활용하여, 신초와 과실에 따라 실제 피해를 주는 우점종이 두 기주식물에 따라 다르다는 것을 보여준다.

 우선, 본 연구를 통해 개발된 종 특이적 프라이머 세트와 PCR 반응조건은 기존에 알려진 방법들과는 다른 것이다. Hada and Sekine (2011)는 본 연구와 동일한 미토콘드리아 COI을 대상으로, 한 가지 reverse 프라이머와 두 종에 각각 특이적일 뿐만 아니라 결합위치도 다른 두 가지 forward 프라이머를 함께 섞어 PCR을 하는 multiplex PCR 방식을 보고한 바 있다. 이 방법에 따르면 복숭아순나방은 513 bp, 복숭아순나방붙이는 1340 bp의 서로 다른 길이의 단편을 한번의 PCR 반응으로 확인할 수 있다고 하였다. 그러나 복숭아순나방붙이에 특이적이라고 하는 forward 프라이머(GdCOI-F2L)의 염기서열이 실제 복숭아순나방붙이의 염기서열과 3군데에서 다른 것이 발견되었다. 이는 COI의 부분 염기서열을 사전에 동정할 때, 이 프라이머보다 5’ 방향으로 단지 2개의 염기가 이동한 위치에 결합하는 유니버셜 프라이머(CJ-J-1718)를 이용하여 클로닝 및 시퀀싱을 하고, 그 염기서열 정보를 가지고 forward 프라이머를 제작하였기 때문에 생긴 오류로 추정된다. 이 프라이머는 복숭아순나방 염기서열과도 3군데에서 불일치하는 것으로 나타나, 종 특이적인 PCR을 수행 시 불명확한 결과를 나타낼 가능성이 있다. 한편, Jung and Kim (2013)은 미토콘드리아에 있는 NADH dehydrogenase 4 (ND4) 유전자의 염기서열 일부를 PCR한 후 제한효소 SwaI을 처리하여 만든 단편들의 다형성으로 두 종을 구별하는 PCR-RFLP 방법을 보고하였다. 여기에 더하여, 동일한 ND4 부위를 대상으로 제한효소 처리 단계가 필요 없이 종 특이적인 프라이머 만을 이용하는 방법도 함께 제시하였다(Jung and Kim, 2013). 본 연구 결과는 COI 부위를 대상으로 하는 분자동정법을 추가로 제시하고 있으며, 기존의 방법과 병행한다면 종 구별의 정확도를 한층 더 높일 수 있을 것으로 보인다.

 자체 개발한 분자동정법을 이용하여 자두과원에서 직접 채집한 해충을 동정한 결과, 복숭아순나방붙이가 자두 과실에 직접적인 피해를 준다는 것을 확인하였다. 복숭아순나방붙이가 자두 과실을 가해한다는 것은 이미 일본에서도 알려져 있으나(Komai, 1979; Oku et al., 1988; Takanashi et al., 2009), Table 2에서 보는 바와 같이, 자두나무의 신초를 가해하는 것이 복숭아순나방이라는 점은 새로 밝혀진 사실이다. 반면에, 복숭아순나방붙이 암컷은 자두 과실 표면에 한 두개의 알을 낳고, 부화한 유충이 표면에 작은 구멍을 뚫고 들어가 식해하며(Oku et al., 1988), 노숙 유충은 과실 표피 바로 아래에서 고치를 만들어 그 속에서 번데기가 된다고 알려져있다(Komai, 1979). 이렇게 복숭아순나방붙이의 생활사가 자두의 신초보다는 과실과 밀접한 관계가 있다는 점은 본 연구결과와 일치한다. 또한, 자두나무 내에서 두 유사종이 신초와 과실을 각기 따로 가해한다는 점 또한 주지할 만한데, 같은 기주식물 내의 서로 다른 먹이자원에 따라 두 종의 공간분포가 달라지는 것이 먹이 종류의 차이에 의한 것인지, 혹은 두 종 간의 경쟁에 의한 것인지는 아직 알려진 바가 없다. 다만, 본 연구결과를 통해, 자두의 신초를 가해한 복숭아순나방 유충이 과실로 이동하지 않고 다른 신초로 옮겨가면서 발육단계를 이어가고, 반면에 과실을 가해한 복숭아순나방붙이 유충은 과실에만 머문다는 것을 간접적으로 알 수 있지만, 신초만 존재하는 봄철 생육초기에는 두 곤충이 어떻게 피해를 주는지에 대해서는 추가 조사가 필요하다.

 한편, 같은 핵과류에 속하는 복숭아의 과실에서는 두 종 가운데 복숭아순나방에 의한 피해가 우점하는 것으로 나타났다(Table 2). 복숭아순나방이 우리나라에서는 사과의 주요 해충으로 알려져 있기는 하지만(Choi et al., 2008), 사과 과실에서는 두 종에 의한 피해가 2:1(복숭아순나방:복숭아순나방붙이)의 비율로 혼재되어있는 것과 비교하면(Choi et al., 2009), 복숭아에 대한 복숭아순나방의 선호성이 매우 뚜렷하다는 것을 알 수 있다. 또한 복숭아와 자두의 신초를 가해하는 것은 모두 복숭아순나방이라는 결과도 주지할 만한데, 사과와 배나무를 비롯한 다른 과수에서도 동일하게 적용되는 현상인지 확인해볼 만하다. 더 나아가 두 유사종의 기주범위와 피해부위를 보다 면밀하게 조사한다면, 종 분화와 관련된 기주식물의 영향 등을 구명하는데 도움이 될 것으로 보인다.

 복숭아순나방붙이가 복숭아에서는 실제적인 피해를 거의 주지 않기 때문에, 지금까지 복숭아에서 보고된 복숭아순나방 연구결과에는 별다른 영향을 미치지 않을 것으로 보인다. 반면에, 자두에서의 복숭아순나방 연구는 국내에서 거의 이루어지지 않았기 때문에, 앞으로 두 종을 잘 구별하여 조사하면 될 것으로 보인다. 사과와 배 등에서도 두 유사종의 직접적인 피해 비율을 정확히 구명한다면, 앞으로 발생 예찰 및 발생 생태 등의 연구와 해충관리 전략수립에 도움이 될 것으로 기대된다.